吸煙2型糖尿病大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4的表達(dá)

王曉蕾 時(shí)藝珊 鞠 巍

（沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110002）

目前，糖尿病和糖尿病前期在中國普通成年人群中高度流行，嚴(yán)重危害人民身體健康[1]。2007年中國糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3980萬，預(yù)計(jì)2025年將達(dá)到5930萬[1]。對糖尿病易患因素及其發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為，吸煙是導(dǎo)致人群多種疾病發(fā)生發(fā)展和死亡的重要影響因素。已有研究表明，吸煙與糖尿?。ㄓ绕?型糖尿病）的發(fā)病有明確關(guān)系[2]。本研究通過觀察吸煙2型糖尿病大鼠肌肉組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達(dá)情況，分析吸煙對2型糖尿病發(fā)病的影響。

表1 第8周及第12周時(shí)三組指標(biāo)比較（±s）

注：1）與8周正常對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；2）與8周2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；3）與8周2型糖尿病吸煙組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；4）與12周正常對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；5）與12周2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

2型糖尿病吸煙組12周（n=20）空腹血糖（mmol/L） 5.00±0.02 9.48±0.071） 9.26±0.091） 5.03±0.03 9.22±0.041）4） 11.01±0.111）2）3）4）5）空腹胰島素（mU/L） 8.84±0.27 20.36±3.021） 19.77±2.681） 9.44±1.34 21.13±2.171）4） 25.65±3.531）2）3）4）5）胰島素抵抗指數(shù) 2.16±0.04 7.95±0.281） 7.92±1.211） 2.25±0.08 8.04±0.281）4） 12.53±1.561）2）3）4）5）GHbA1c（%） 4.29±0.34 8.01±0.241） 7.85±0.311） 4.76±0.32 8.12±0.421）4） 8.34±0.461）4）TC（mmol/L） 1.08±0.06 1.70±0.071） 1.69±0.121） 1.10±0.06 1.73±0.101）4） 1.79±0.031）4）TG（mmol/L） 0.48±0.05 1.21±0.071） 1.29±0.131） 0.56±0.02 1.31±0.111）4） 1.35±0.091）4）LDL-C（mmol/L） 0.45±0.03 0.76±0.041） 0.72±0.051） 0.48±0.01 0.81±0.041）4） 1.16±0.061）2）3）4）5）HDL-C（mmol/L） 0.98±0.01 0.76±0.06 0.79±0.05 0.86±0.04 0.68±0.051）4） 0.67±0.021）4）指標(biāo) 正常對照組8周（n=20）2型糖尿病非吸煙組8周（n=20）2型糖尿病吸煙組8周（n=20）正常對照組12周（n=20）2型糖尿病非吸煙組12周（n=20）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

取60只Wistar大鼠（購自中國醫(yī)科大學(xué)），8周齡，雄性，清潔級。體質(zhì)量130~200g。去除體重差異較大的大鼠，隨機(jī)分配為3組。①正常對照組20只。②2型糖尿病非吸煙組20只。③2型糖尿病吸煙組20只。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑

顆粒飼料（購自中國醫(yī)科大學(xué)）；高糖高脂飼料（自配）；鏈脲佐菌素（streptoztocin, STZ，美國Sigma公司）；香煙為市售X牌香煙，尼古丁含量1mg/支，焦油含量18mg/支。RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT-PCR試劑盒（美國Ambion公司）。引物由大連寶生物工程有限公司合成。日立7170全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）；PCR儀（德國Biometra公司）；Chemi Imager 5500凝膠圖像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立

①確定胰島素抵抗動(dòng)物模型：三組大鼠均每籠3~4只，飼養(yǎng)7周，室溫21~26℃，濕度50~60oC，12h光照周期，動(dòng)物室內(nèi)每天清掃消毒。正常對照組予普通飼料喂養(yǎng)，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。飲水為純凈水。三組均喂養(yǎng)7周。②小劑量STZ靜脈注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型[3]：2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組大鼠尾靜脈注射STZ 15 mg/kg（以pH值4.5的0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成0.3%濃度），對照組僅注射枸櫞酸鈉緩沖液。三組繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)1周后檢測血糖及胰島素等指標(biāo)，根據(jù)隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L確定2型糖尿病動(dòng)物模型[4]，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組共40只大鼠均造模成功。③將2型糖尿病吸煙組大鼠20只關(guān)進(jìn)自制“被動(dòng)吸煙箱”內(nèi)。箱上方有通風(fēng)口與外界相通，側(cè)壁有與香煙直徑相通的孔，點(diǎn)燃的香煙煙霧由側(cè)壁孔擴(kuò)散至整個(gè)箱內(nèi)。大鼠在此環(huán)境中吸煙，每天吸煙2次，兩次間隔4h，每次30min。2型糖尿病非吸煙組及對照組大鼠同時(shí)也被關(guān)進(jìn)“吸煙箱”，相同時(shí)間，不輸入香煙煙霧。共4周后檢測三組血糖及胰島素等指標(biāo)進(jìn)行比較。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠均無死亡。

1.2.2 指標(biāo)測定

空腹血糖及胰島素、糖化血紅蛋白、血脂檢查均為禁食水12h后尾靜脈采血測定。①血糖測定：第8周、第12周各測一次空腹血糖。②第8周、第12周各測一次空腹胰島素水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血漿血糖（mmol/L）×空腹血清胰島素（mU/L）/22.5[5]。③第8周、第12周各測一次糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，GHbA1c）。④第8周、第12周各測一次血脂，包括血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterin，HDL-C）。

1.2.3 PCR法檢測GLUT4的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)12周時(shí)三組大鼠均處死。①取骨骼肌組織冷凍保存。②應(yīng)用RNA提取液提取總RNA。按試劑盒說明合成cDNA。③設(shè)計(jì)GLUT4正向和反向引物：上游5'-GCGTGGGTTTCGTGCTTT-3'，下游5'-GGTAGTTCCCGATGGCTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片斷長度為154 bp。④按試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行競爭性RT-PCR反應(yīng)。采用競爭性引物混合物（primer∶competimer 比例 2∶8），在擴(kuò)增目標(biāo)基因的同時(shí)擴(kuò)增rRNA（489 bp）作為內(nèi)對照。PCR循環(huán)擴(kuò)增條件為94oC預(yù)熱3min，94oC變性30s，56oC退火30s，72oC延伸60s。循環(huán)30個(gè)周期后72oC延伸4min。⑤2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色。紫外燈下觀察, 拍照。應(yīng)用密度測定系統(tǒng)測定分析電泳帶的密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)采用T檢驗(yàn)，單因素相關(guān)分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 第8周2型糖尿病造模成功，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明顯高于對照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。第12周2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明顯高于對照組，HDL-C明顯低于對照組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；2型糖尿病吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、LDL-C水平均明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（表1）。

2.2 第12周時(shí)取三組大鼠骨骼肌組織，PCR法檢測GLUT4表達(dá)。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達(dá)均明顯低于對照組，2型糖尿病吸煙組GLUT4表達(dá)明顯低于2型糖尿病非吸煙組。2型糖尿病非吸煙組較對照組下調(diào)3.4倍，2型糖尿病吸煙組較對照組下調(diào)9.8倍，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。GLUT4表達(dá)與三組胰島素抵抗指數(shù)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為–0.825，P＜0.01）。（見表2及圖1）。

表2 第12周時(shí)三組胰島素抵抗指數(shù)及GLUT4比較（±s）

表2 第12周時(shí)三組胰島素抵抗指數(shù)及GLUT4比較（±s）

注：1）與正常對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；2）與2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

2型糖尿病吸煙組（n=20）胰島素抵抗指數(shù) 2.25±0.08 8.04±0.281） 12.53±1.561）2）GLUT4 1.45±0.02 0.43±0.021） 0.15±0.011）2）指標(biāo) 正常對照組（n=20）2型糖尿病非吸煙組（n=20）

圖1 第12周時(shí)三組大鼠骨骼肌組織GLUT4表達(dá)比較

3 討 論

世界范圍內(nèi)，吸煙是人類的一個(gè)重要死亡原因[6]。吸煙與腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等疾病發(fā)病均有重要關(guān)系[7,8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，戒煙成功可降低人群病死率，但既往吸煙史所帶來的不良影響仍會(huì)持續(xù)數(shù)年，糖尿病患者表現(xiàn)更為突出[8]。

吸煙通過多種機(jī)制影響糖尿病的發(fā)生發(fā)展，包括胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞損傷等，其中胰島素抵抗為其主要方面[9]，而胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制。本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)及靜脈注射STZ誘導(dǎo)方法成功制備出2型糖尿病大鼠模型，并通過計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)對其胰島素抵抗程度進(jìn)行評價(jià)。而后將2型糖尿病吸煙組大鼠置于吸煙箱內(nèi)繼續(xù)觀察。研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)12周時(shí)吸煙2型糖尿病大鼠的空腹血糖及胰島素水平均明顯高于2型糖尿病非吸煙組和對照組，胰島素抵抗指數(shù)明顯增高，說明吸煙確實(shí)能夠加重胰島素抵抗，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

胰島素抵抗主要表現(xiàn)為外周組織對葡萄糖的攝取利用下降。吸煙可通過多種途徑加重胰島素抵抗，包括脂代謝紊亂及肥胖；血管內(nèi)膜損傷；胰島素受體敏感性受損等[10]。同時(shí)，尼古丁還可以通過興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而妨礙葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力是葡萄糖利用的關(guān)鍵步驟，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的損傷可以導(dǎo)致胰島素抵抗[11]。本研究中第12周時(shí)取三組大鼠骨骼肌組織，PCR法檢測GLUT4表達(dá)。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達(dá)均明顯低于對照組，而2型糖尿病吸煙組較2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達(dá)減低更加明顯，且與三組胰島素抵抗指數(shù)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，說明骨骼肌組織中GLUT4的表達(dá)與胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。GLUT4是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于對胰島素敏感的骨骼肌、心肌、脂肪及腎小球系膜細(xì)胞、入球小動(dòng)脈平滑肌段的上皮細(xì)胞等細(xì)胞中[12,13]。研究表明，GLUT4在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中起著重要作用[14]，其表達(dá)水平與骨骼肌、脂肪組織等的胰島素抵抗情況密切相關(guān)，可影響2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[15]。而本研究提示，長期吸煙可能通過減低骨骼肌組織中GLUT4的表達(dá)水平增加胰島素抵抗，促進(jìn)2型糖尿病的進(jìn)展。

通過本試驗(yàn)研究我們得出結(jié)論，吸煙可通過降低骨骼肌GLUT4的表達(dá)增加胰島素抵抗，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，危害人類健康。因此，我們積極倡導(dǎo)廣泛戒煙，養(yǎng)成良好生活方式，對早期預(yù)防2型糖尿病具有積極意義。

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