HPLC測定氟西汀血藥濃度及其臨床應(yīng)用

徐學君，陶 慶，徐德琴(.武警安徽總隊醫(yī)院藥劑科，安徽合肥3006;.解放軍08醫(yī)院藥劑科，上海00336)

氟西汀(fluoxetine hydrochloride，F(xiàn)LU)，即(±)-N-甲基-3-苯基-3-［(2，2，2-三氟-P-甲苯基)-氧代］丙胺鹽酸鹽，是一種選擇性的5-羥色胺重攝取抑制劑(SSRIs)，由美國禮來公司研制，于20世紀90年代初上市，具有良好的振奮情緒、改善抑郁效應(yīng)，目前被當作一線藥物廣泛應(yīng)用于臨床［1，2］。與多數(shù)SSRIs不同，氟西汀有較長的半衰期，并呈現(xiàn)非線性藥代動力學過程和較大的個體差異［1］。對于FLU的血藥濃度測定多數(shù)采用高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)［3］或熒光檢測［4］及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)［5～7］測定。其中前者的檢測靈敏度受到一定限制，不能滿足低濃度的測定［3，4］;而LC/MS法對儀器設(shè)備要求較高，不適宜于普通醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)用。在上述方法中，樣品預(yù)處理多采用液-液萃?。?，4，7］或固相萃取法［5］，前者操作較繁瑣，后者成本較高。筆者采用蛋白沉淀預(yù)處理法和HPLCUV檢測建立其快速、簡便的血藥濃度檢測方法，以便為臨床個體化藥物治療進行治療藥物監(jiān)測服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鹽酸氟西汀標準品(批號: 100513-200401，純度98.5%)，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品。乙腈為德國MERC公司產(chǎn)HPLC純?nèi)軇?磷酸氫二鈉(分析純，純度＞99.0%)由天津金匯太亞化學試劑有限公司生產(chǎn);氫氧化鈉(分析純，純度＞96.0%)由上海之臻化工有限公司生產(chǎn)。超純水為本院制劑室自制去離子雙蒸水。

1.2 血漿樣品預(yù)處理 精密量取人空白血漿200 μl于1.5 ml離心管中，精密加入400 μl乙腈，渦旋混合2 min后，14 000 r/min離心10 min，吸取上清液，0.45 μm濾膜過濾，精密量取濾過液350 μl，40℃氮氣吹干，精密量取流動相100 μl溶解完全后，24 h內(nèi)進樣測定。

1.3 儀器 LC-10ATVP泵(日本島津公司);SPD-10Avp檢測器(日本島津公司);N2000工作站(浙江大學智達信息工程有限公司);VXH旋渦混合器(上海和欣科教設(shè)備有限公司);TGI20M臺式高速冷凍離心機(湖南凱達實業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2(5 μm，4.6 mm×200 mm);流動相:乙腈-25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)=34∶66;流速:1.2 ml/min;紫外檢測波長:227 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μl。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 取人血漿樣品按1.2下方法處理，按1.4色譜條件下進樣，所得色譜圖如圖1所示。由圖可見FLU的色譜峰保留時間約為10.2 min，峰型對稱。

2.2 線性關(guān)系考察 精密量取FLU對照品溶液適量，加入一定量的人空白血漿稀釋成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/ml系列對照血漿樣品，渦旋混勻后分別按1.2項下方法預(yù)處理樣品后，進樣20 μl，以平均色譜峰面積(n=3)對FLU血漿濃度線性回歸，得回歸方程為C=3.185×10－4A+0.1338，相關(guān)系數(shù)r=0.996 9。結(jié)果表明FLU在0.5～50 ng/ ml濃度范圍內(nèi)血漿樣品濃度與峰面積線性關(guān)系良好，F(xiàn)LU的最低定量限(LLOQ)為0.5 ng/ml，RSD為14.53%。

2.3 特異性試驗 考察6個不同個體空白血漿色譜圖、空白血漿加氟西汀對照品色譜圖，血漿內(nèi)源性物質(zhì)均不影響FLU的測定，如圖1-A、B所示。

圖1 FLU血漿樣品的HPLC色譜圖A-FLU標準對照血漿樣品;B-空白血漿;C-受試者服藥后6 h血漿樣品

2.4 提取回收率試驗 精密量取FLU標準品儲備液適量加入到空白血漿中，分別配制低、中、高濃度約為1、5、50 ng/ml的標準對照血漿樣品各5份，按1.2項下方法預(yù)處理后進樣分析。另取相同濃度的FLU標準液，直接進樣測定。分別記錄峰面積，計算提取回收率。試驗結(jié)果見表1。

表1 FLU在血漿樣品提取中的回收率(n=5)

由上表可見，本方法的提取回收率較穩(wěn)定，且基本達到了75%以上。

2.5 方法回收率 分別配制低、中、高3組濃度FLU標準對照血漿樣品各5份，按1.2方法預(yù)處理后連續(xù)進樣，將計算結(jié)果與配制濃度相比，計算方法回收率，結(jié)果見表2。

表2 血漿樣品中FLU濃度測定方法回收率(n=5)

結(jié)果表明方法的回收率良好。

2.6 精密度試驗 于日內(nèi)不同時間配制低、中、高3個濃度各5個對照血漿樣品，按1.2方法處理后測定，代入回歸方程，得日內(nèi)精密度。于第1、2、3天分別配制測定，代入當天回歸方程，得日間精密度。結(jié)果如表3所示。

表3 血漿樣品中FLU含量測定方法精密度(n=5)

結(jié)果表明，方法的日內(nèi)、日間精密度良好，符合體內(nèi)藥物濃度測定的基本要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗

2.7.1 樣品存放期的穩(wěn)定性 取空白血漿數(shù)份，分別加入FLU標準溶液，使血漿中FLU的濃度分別為1.0，5.0和50.0ng/ml，放置在－18℃的冰箱中，分別于第0天和第30天取樣分析，考察其在存放期間的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 樣品在存放期間穩(wěn)定性(n=3)

以上數(shù)據(jù)說明該生物樣品在－18℃的冰箱中至少能保存30 d。

2.7.2 樣品凍融穩(wěn)定性 取空白血漿數(shù)份，分別加入FLU標準溶液，使血漿中 FLU的濃度分別為1.0，5.0和50.0 ng/ml，放置在－18℃冰箱中，然后反復凍融3次測定其濃度，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。

表5 樣品反復凍融穩(wěn)定性(n=3)

以上數(shù)據(jù)說明該生物樣品在凍融3次后仍較穩(wěn)定。

2.7.3 樣品在進樣器中的穩(wěn)定性 取空白血漿數(shù)份，分別加入FLU標準溶液，使血漿中FLU的濃度分別為1.0，5.0和50.0 ng/ml，血樣預(yù)處理后作HPLC分析。然后將溶液放在進樣器中24 h后取樣測定，從而考察樣品在進樣器和流動相中的穩(wěn)定性，結(jié)果見表6。

表6 樣品在進樣器中的穩(wěn)定性(n=3)

以上數(shù)據(jù)說明該樣品用流動相溶解后在進樣器中保存24 h后仍較穩(wěn)定，故預(yù)處理后樣品液在試驗過程中保持穩(wěn)定，能夠滿足試驗方法學要求。

2.8 臨床應(yīng)用 患者8名，男性6名，女性2名，年齡19～71歲 ，平均(42.75±19.22)歲 ，口服FLU分散片(百優(yōu)解，20 mg/片)20 mg后6 h采取靜脈血1 ml，離心分離血漿后按1.2項下方法預(yù)處理，并進樣測定其血漿FLU濃度(圖1-C)，結(jié)果見表7。全部患者的濃度范圍為5.35～18.77 ng/ml，平均為(12.06±5.61)ng/ml。

表7 8名患者口服20 mg FLU后6 h的血藥濃度

3 討論

FLU是目前臨床上普遍應(yīng)用的抗抑郁藥物，且其臨床應(yīng)用近年來已有較大擴展［2］。但是，由于該藥物在體內(nèi)呈非線性藥代動力學，且代謝過程受P450酶多態(tài)性及合并用藥等諸多因素的影響［1］，使個體差異較大。因此，在臨床重點患者中進行其血藥濃度監(jiān)測具有必要性。

文獻［3，8，9］分別報道了HPLC-UV檢測FLU的血藥濃度檢測，基本都采用了液-液萃取法處理血漿樣品，但是操作相對較繁瑣，方法的LLOQ均在10 ng/ ml左右，不能滿足更多低濃度樣品的測定。文獻［6］報道采用蛋白沉淀預(yù)處理方法，簡化了操作過程，筆者對其進行了優(yōu)化改進，使LLOQ可達到0.5 ng/ ml，提高了方法的檢測靈敏度，且整個操作較為簡便快速，可滿足于臨床治療藥物監(jiān)測和其它目的血藥濃度測定的需要。

對8例患者服藥后6 h(理論達峰時間［10］)的血藥濃度測定結(jié)果表明，本法在上述臨床應(yīng)用中尚未見患者合并用藥的干擾，適合用于臨床治療藥物監(jiān)測。但測得濃度個體差異較大，如何應(yīng)用本法為臨床個體化用藥服務(wù)，鑒于測定標本數(shù)量有限，尚待進一步積累數(shù)據(jù)考察。

［1］ Cheer SM，Goa KL.Fluoxetine:a review of its therapeutic potential in the treatment of depression associated with physical ill-ness［J］.Drugs，2001，61(1)∶81.

［2］ 汪春運，臧家平.氟西汀的臨床應(yīng)用［J］.醫(yī)藥導報，2005，24 (10):897.

［3］ 劉偉忠，陳清霞，黃偉僑，等.高效液相色譜法同時測定人血漿中氯氮平與氟西汀的濃度［J］.廣東藥學院學報，2011，27 (3):243.

［4］ 李迎春，姚國燦，郭興杰，等.高效液相色譜法測定大鼠腦微滲析液中氟西汀的濃度［J］.中國藥房，2006，17(5):341.

［5］ 何 娟，周志凌，李煥德.HPLC-MS同時測定4種新型抗抑郁藥物的血藥濃度［J］.藥物分析雜志，2005，25(12):1428.

［6］ 賈晶瑩，張夢琪，桂雨舟，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定7種抗抑郁類和5種抗精神病類藥物的血藥濃度［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2010，7(5):272.

［7］ Franceschi L，F(xiàn)aggiani A，F(xiàn)urlanut M.A simple method to monitor serum concentrations of fluoxetine and its major metabolite for pharmacokinetic studies［J］.J Pharm Biomed Anal.2009，49(2):554.

［8］ 肖 紅，周 群，張石寧，等.HPLC測定人血清中氟西汀的濃度［J］.江蘇藥學與臨床研究，2000，8(4):36.

［9］ 李 玲，袁 波，朱榮申，等.高效液相色譜法檢測抑郁癥患者血清中氟西汀的濃度［J］.中國藥學雜志，2002，37(l1): 855.

［10］ 邵慶翔，李 川，張美云，等.鹽酸氟西汀分散片和膠囊的生物等效性研究［J］.中國新藥雜志，2003，12(4):277.