連翹酯苷對擬AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶的改善作用

李長祿，王紅梅，王立為

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193)

隨著人們生活水平的提高，人均壽命隨之增加，全球人口趨于老齡化，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率逐年上升，已成為威脅人們晚年健康的一大隱患。迄今為止，AD患者依然缺乏有效的治療藥物，目前的藥物大部分只對AD的某一環(huán)節(jié)有阻斷作用，并不能阻斷AD發(fā)病的病程，所以這些藥物能夠改善AD早、中期的癥狀，但對AD晚期療效較差。因此，尋找能夠阻斷AD病程發(fā)展的多靶點(diǎn)藥物具有更重要的意義。天然藥物作用靶點(diǎn)多且毒性低，所以中藥或中藥提取物已經(jīng)成為當(dāng)前研究AD治療藥物的熱點(diǎn)。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要有如下幾種假說:膽堿能假說、氧化應(yīng)激假說、炎癥免疫假說、淀粉樣蛋白假說、基因突變假說等。目前藥物的研究主要集中在氧自由基、炎癥因子及中樞神經(jīng)元凋亡三個(gè)方面。連翹為木犀科植物的干燥果實(shí)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。連翹酯苷為其主要活性成分，具有抗菌、抗炎及體外抗氧化等藥理作用。我們于2011年7～9月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，旨在通過檢測動(dòng)物行為學(xué)變化及生化指標(biāo)的改變，來評價(jià)連翹酯苷用于治療AD的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12月齡SPF級昆明(KM)雄性小鼠60只，2月齡SPF級KM雄性小鼠10只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號:SCXK (京)2009-0007。藥用植物研究所SPF動(dòng)物房中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度22～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 藥物與試劑 連翹酯苷:由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)室制備;安理申:衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，批號090807A;人參皂苷Rg1:上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號100329;β-淀粉樣蛋白(25-35)(Aβ25-35):Sigma產(chǎn)品，批號108K4794;乙酰膽堿酯酶(AchE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、單胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 小鼠自主活動(dòng)儀及Morris水迷宮實(shí)時(shí)在線檢測分析處理系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心、北京三維拓盟數(shù)字影像技術(shù)有限公司聯(lián)合研制開發(fā)。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35的配制與老化 將1 mg Aβ25-35用生理鹽水配制成2 mg/mL的母液，置37℃ CO2恒溫箱孵育4 d，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35［1］。

1.4.2 動(dòng)物分組與給藥 10只2月齡小鼠為青年對照組，60只12月齡小鼠隨機(jī)分為6組，即老年對照組、模型組、連翹酯苷低劑量組(50 mg/kg)、連翹酯苷高劑量組(200 mg/kg)、安理申組(3 mg/kg)及人參皂苷Rg1組(10 mg/kg)，以上各組按相應(yīng)劑量的藥物灌胃，青年對照組、老年對照組和模型組小鼠以相同方法灌胃蒸餾水，1次/d，連續(xù)5周。

1.4.3 AD動(dòng)物模型的建立［2］灌胃第21天時(shí)，除青年對照組和老年對照組外各組小鼠分別于腹腔注射0.8%戊巴比妥鈉0.1 mL/10 g，待其麻醉后，右側(cè)側(cè)腦室(前囟后2 mm，旁開1.5 mm，深度2.5 mm)注射Aβ25-356 μg。

1.4.4 自主活動(dòng) 自主活動(dòng)計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)在線檢測分析處理系統(tǒng)主要用于觀察藥物對小鼠是否有興奮或抑制等影響。側(cè)腦室注射10 d后將小鼠放入自主活動(dòng)測試箱，適應(yīng)5 min，測試10 min，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均運(yùn)動(dòng)速度。

1.4.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［3］灌胃給藥32 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)6 d。定位航行實(shí)驗(yàn):灌胃給藥1 h后將動(dòng)物面向池壁置于水池內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 d，1次/d，每次120 s，記錄動(dòng)物逃避潛伏期和游出率?？臻g探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)后將平臺撤去，從目標(biāo)象限的對角象限將動(dòng)物面向池壁置于池內(nèi)，使動(dòng)物在池內(nèi)游泳120 s，記錄動(dòng)物穿臺次數(shù)。

1.4.6 腦組織生化指標(biāo)檢測 待水迷宮測試結(jié)束后將小鼠處死，迅速分離海馬和皮層，液氮速凍。檢測時(shí)將皮層超聲勻漿制成10%的腦組織勻漿液，4℃以3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明測定SOD、AchE、ChAT、MAO活力以及MDA含量。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，進(jìn)行多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間差異采用LSD(方差齊)或者Games-Howell法(方差不齊)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自主活動(dòng)測試結(jié)果 見表1。

表1 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠自主活動(dòng)的影響(±s，n=10)

表1 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠自主活動(dòng)的影響(±s，n=10)

組別 平均速度(cm/s)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間(s)靜息總時(shí)間(s) 1.86±0.22 139.72±12.85 760.13±12.85老年對照組 2.09±0.30 156.22±19.46 743.65±19.74模型組 1.72±0.36 134.64±24.69 765.22±24.68安理申組 1.25±0.22 99.89±15.12 799.99±15.12人參皂苷Rg1組 1.50±0.32 118.34±18.94 781.53±18.94連翹酯苷高劑量組 1.71±0.31 134.22±21.90 765.65±21.90連翹酯苷低劑量組青年對照組1.65±0.25 128.54±15.98 771.33±15.99

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3。而在探索實(shí)驗(yàn)中，青年對照組、老年對照組、模型組、安理申組、人參皂苷Rg1組、連翹酯苷高劑量組、連翹酯苷低劑量組穿臺次數(shù)分別為(0.94±0.14)、(0.72±0.14)、(0.50±0.13)、(0.61±0.13)、(0.50±0.75)、(1.00±0.18)、(1.04±0.22)次。與青年對照組比較，模型組小鼠在目標(biāo)象限穿臺次數(shù)減少(P＜0.05)。長期給予小鼠連翹酯苷可明顯增加小鼠穿臺次數(shù)(P＜0.05)，改善小鼠空間探索能力;而安理申和人參皂苷Rg1的穿臺次數(shù)與模型組比較并未出現(xiàn)顯著性差異。

表2 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠游出率的影響(±s，n=10)

表2 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠游出率的影響(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 0.50±0.19 0.63±0.18 0.38±0.18 0.78±0.15 0.88±0.13老年對照組 0.13±0.13 0.50±0.19 0.63±0.18 0.88±0.13* 0.88±0.13*模型組 0.00±0.00# 0.14±0.14 0.57±0.20 0.43±0.20 0.43±0.20#安理申組 0.50±0.22* 0.83±0.17* 0.50±0.22 0.83±0.17 0.83±0.17人參皂苷Rg1組 0.43±0.20 0.57±0.20 0.43±0.20 0.71±0.18 1.00±0.00*連翹酯苷高劑量組 0.14±0.14 0.43±0.20 0.75±0.16 1.00±0.00* 0.86±0.14*連翹酯苷低劑量組 0.33±0.21 0.17±0.17 0.83±0.17 0.83±0.17 1.00±0.00*

表3 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠潛伏期的影響(s，±s，n=10)

表3 連翹酯苷對Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠潛伏期的影響(s，±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 94.00±13.88 65.79±17.48 74.27±18.42 24.03±7.33 20.23±7.60老年對照組 109.67±9.64 78.27±15.78 78.03±19.69 36.39±9.43* 36.94±11.48*模型組 119.29±0.11 106.92±12.35# 109.10±10.13 98.75±13.26# 90.12±18.43#安理申組 85.47±15.68* 69.52±11.76 75.86±24.48 41.44±11.75* 49.94±19.64人參皂苷Rg1組 99.90±11.32 89.87±14.27 84.87±18.08 48.34±18.33* 39.85±11.45*連翹酯苷高劑量組 115.89±3.37 102.11±11.42 75.96±14.86 33.77±10.01* 34.11±5.47*連翹酯苷低劑量組 102.66±12.49 105.00±14.12 76.77±13.77 34.50±12.41* 38.02±15.64*

2.3 腦組織生化指標(biāo)檢測 見表4、5。

表4 腦組織海馬AchE、ChAT、SOD活力檢測結(jié)果(±s，n=10)

表4 腦組織海馬AchE、ChAT、SOD活力檢測結(jié)果(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) 4.06±0.29 128.19±5.73 115.37±10.24老年對照組 4.47±0.34 81.09±12.08# 111.96±4.29模型組 5.69±0.56# 73.60±11.27# 97.46±3.83#安理申組 4.69±0.10 87.56±22.15 112.85±5.20人參皂苷Rg1組 5.24±0.42 107.33±20.12 135.52±4.25*連翹酯苷高劑量組 4.01±0.40* 128.64±12.88* 119.42±6.01*連翹酯苷低劑量組 4.90±0.27 108.10±10.42* 117.51±5.45青年對照組*

3 討論

AD由巴伐利亞的神經(jīng)病理學(xué)家Alois Alzheimer 1907年首先發(fā)現(xiàn)。AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退和智力下降。病理特征主要以老年斑、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)、淀粉樣蛋白(Aβ)沉積以及神經(jīng)元空泡變性和大量喪失為主。

Aβ級聯(lián)假說認(rèn)為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD的一個(gè)主要病理特征，現(xiàn)已公認(rèn)Aβ是引起AD的主要因素，使用Aβ來造成AD的模型成為理想的研究AD的途徑［4］，在AD藥物篩選中應(yīng)用廣泛。本課題選用右側(cè)側(cè)腦室注射Aβ25-35建立擬AD動(dòng)物模型，其優(yōu)點(diǎn)是可以模擬AD的學(xué)習(xí)記憶障礙、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷等行為學(xué)和病理學(xué)方面的特征。另外，劉克明等［5，6］報(bào)道，在行為學(xué)試驗(yàn)中，自然衰老小鼠(15月齡)水迷宮逃避潛伏期明顯延長，說明其學(xué)習(xí)記憶能力減退，腦組織腎上腺素和組織多巴胺均降低。因此，相對于年輕小鼠腦室注射Aβ模型來說，本實(shí)驗(yàn)在衰老的基礎(chǔ)上給予Aβ?lián)p傷模型更符合老年癡呆臨床基礎(chǔ)，在AD藥物篩選中更具有說服力。

表5 腦組織皮層AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量檢測結(jié)果(±s，n=10)

表5 腦組織皮層AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量檢測結(jié)果(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) MAO (U/mg prot) MDA (U/mg prot)青年對照組 6.01±0.61 38.03±2.73 56.86±1.96 17.76±0.1913.87±2.15老年對照組 6.18±0.26 26.13±1.87# 46.72±1.06# 18.30±1.93 15.01±1.83模型組 8.00±0.49# 14.39±1.19# 49.53±1.16# 24.05±0.43# 26.26±2.26#安理申組 6.56±1.16 27.27±7.13* 54.46±1.63* 19.11±1.27* 17.81±2.07*人參皂苷Rg1組 5.30±0.34* 34.16±4.84* 48.86±3.14 23.81±0.64 14.80±1.24*連翹酯苷高劑量組 6.28±0.32* 30.07±3.23* 55.28±2.17* 16.64±0.56* 17.34±1.12*連翹酯苷低劑量組 7.39±0.49 24.34±1.63 51.86±0.47 17.36±2.54*21.94±0.53

從水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，Aβ25-35側(cè)腦室注射復(fù)合自然衰老模型小鼠游出率明顯下降，逃避潛伏期明顯延長，在空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越原平臺次數(shù)減少，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，而沒有接受Aβ25-35損傷的12月齡自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有所下降，但與2月齡年輕小鼠沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而連翹酯苷可明顯提高模型組小鼠的游出率，縮短逃避潛伏期，增加穿臺次數(shù)。從行為學(xué)的角度可以看出，連翹酯苷可以改善模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)安理申和人參皂苷Rg1在水迷宮實(shí)驗(yàn)中也可不同程度的改善模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

衰老過程中，神經(jīng)元細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化可產(chǎn)生大量自由基，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡。同時(shí)氧自由基造成的氧化應(yīng)激能促進(jìn)Tau蛋白的異常磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)，進(jìn)而促使AD的形成［7］。SOD是機(jī)體清除自由基的重要酶類，其作用主要是催化生物氧化產(chǎn)生超氧自由基，清除并阻止由氧自由基引發(fā)的自由基連鎖反應(yīng)。MDA是自由基對生物細(xì)胞膜損傷的主要代謝產(chǎn)物，能使生物膜變性、壞死，使DNA發(fā)生突變、交鏈，同時(shí)使SOD活性降低，而造成自由基連鎖反應(yīng)的惡性循環(huán)［8］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示連翹酯苷可以顯著地提高模型組小鼠腦組織海馬、皮層中SOD的活性，同時(shí)降低模型組小鼠腦組織皮層中MDA的活性。提示連翹酯苷可以通過抑制氧自由基的形成，改善模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)安理申和人參皂苷Rg1也可以不同程度的改善這兩個(gè)指標(biāo)。

海馬與大腦皮質(zhì)投射的基底前區(qū)腦膽堿能系統(tǒng)神經(jīng)元及突觸的大量損傷、喪失是AD患者記憶、認(rèn)知能力減退的主要原因。AchE和ChAT是反映中樞膽堿能系統(tǒng)代謝的一對特異性酶，兩者活性直接影響腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)的含量［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示連翹酯苷可以使模型組小鼠腦組織海馬、皮層中ChAT的活性顯著升高，同時(shí)顯著地降低AchE的活性。從而改善了改善膽堿能系統(tǒng)，增加腦內(nèi)Ach水平，從而提高膽堿能神經(jīng)元的興奮性，提高了學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)安理申和人參皂苷Rg1也可以不同程度的改善這兩個(gè)指標(biāo)。

MAO是大腦周圍神經(jīng)組織中一種十分重要的酶，不僅能提高有害的H2O2的水平，而且是代謝多巴胺、去甲腎上腺素與腎上腺素等兒茶酚胺遞質(zhì)類的重要酶，可以使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量下降，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的老化過程。所以MAO活性表達(dá)變化，也可在一定程度上反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺能神經(jīng)—兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示連翹酯苷和安理申可以顯著地使模型組小鼠腦組織皮層中MAO的活力下降，提示連翹酯苷AD小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)可能具有重要的保護(hù)作用。

綜上所述，連翹酯苷對AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙具有改善作用，可能是連翹酯苷的抗氧化作用和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝系統(tǒng)綜合效應(yīng)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)為以后對連翹酯苷在抗老年癡呆新藥研制中提供了依據(jù)。

［1］Kim DH，Kim S，Jeon SJ，et al.The effects of acute and repeated oroxylin A treatments on Abeta(25-35)-induced memory impairment in mice［J］.Neuropharmacology，2008，55(5):639-647.

［2］Nakdook W，Khongsombat O，Taepavarapruk P，et al.The effects of Tabernaemontana divaricata root extract on amyloid beta-peptide 25-35 peptides induced cognitive deficits in mice［J］.J Ethnopharmacol，2010，130(1):122-126.

［3］高冰冰，徐淑萍，劉新民，等.開心散與去茯苓開心散改善擬AD動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶作用比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(7): 57-62.

［4］Li DB，Tang J，F(xiàn)an XT，et al.Comparative study of histopathology changes between the PS1/APP double transgenic mouse model and Abeta1-40-injected rat model of Alzheimer disease［J］.Neurosci Bull，2006，22(1):52-57.

［5］劉克明，王春花，李國星，等.D-半乳糖模型鼠與自然衰老鼠的比較研究［J］.衛(wèi)生研究，2007，36(6):685-688.

［6］趙彩紅，王欽富.小鼠自然衰老模型的評價(jià)［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003，12(5):588-589.

［7］孫磊，楊瑩，竇彩艷.阿爾茲海默病治療的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)信息:中旬刊，2010，5(7):1969-1970.

［8］李鐘勇，張鵬.美洛昔康對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織SOD，MAO-B，MDA的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28(2):99-103.

［9］王憶杭，肖培根，劉新民.連翹酯苷對擬AD復(fù)合動(dòng)物模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機(jī)制研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，19(5):423-427.