桑葉片總RNA提取方法的比較研究

王阿娜， 裴 瑾， 劉 薇， 萬德光， 張祎楠

(成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川成都610075)

桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？浦参锷orus alba L．的干燥葉。我國各地均有野生或栽培，以安徽、浙江、江蘇等南方育蠶區(qū)產(chǎn)量較大，初霜后采收。本品氣微，味淡，微苦澀。具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、平抑肝陽、清肝明目的功效，廣泛應(yīng)用于臨床［1］。桑葉是我國的傳統(tǒng)中藥之一，含有多種成分，如脂類、維生素、生物堿、多糖、植物甾醇、氨基酸、黃酮類等，此外，還含有甾體及三萜類化合物、揮發(fā)油、有機(jī)酸及葉綠素、葉黃素等其他功能性成分，具有降血壓、降血脂、降低膽固醇、降血糖、抗衰老、提高免疫能力等多種生理功能。目前對桑葉的研究多集中在其生物學(xué)特征、主要成分、藥理作用及其在食品藥品、絲綢業(yè)的應(yīng)用［2］，而對桑葉和次生代謝生物合成途徑的功能基因研究相對較少。桑葉中黃酮類成分類型多樣，主要有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花色素、黃烷醇等多種類型，要深入研究桑葉黃酮類生物合成途徑中功能基因的關(guān)鍵一環(huán)是提取純度較高、完整性較好的總RNA。根據(jù)提取RNA方法的有關(guān)報道［3-4］，由于植物材料細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞內(nèi)含有多糖、蛋白質(zhì)及色素、酚類等物質(zhì)，不利于RNA的提取及其后續(xù)試驗［5］。桑葉中含有較多的黃酮類、多糖、蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)以及RNase的廣泛存在，常常使獲得純度較高的桑葉片總RNA更加困難。常見的總 RNA 提取方法有苯酚法［6］、LiCl-尿素法［7］、異硫氰酸胍法［8］、CTAB［9］法、熱硼酸法［10］以及 Trizol法。本試驗通過采用3種不同的提取試劑法 (盒)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析比較，以期獲得一種較為理想的提取方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 桑葉采自于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)裴瑾教授鑒定為?？浦参锷orus alba L．，取其成熟葉片，用清水沖洗其上面的灰塵，用70%的乙醇消毒，再用無菌水沖洗后，置于消毒濾紙上吸干水分，并迅速放入液氮中保存?zhèn)溆?。試驗操作中所使用的塑料制品均?.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水處理12 h，然后高壓滅菌后備用。玻璃器皿置于180℃干熱滅菌8 h。電泳槽等儀器用3%的H2O2處理，再用0.1%DEPC水沖洗干凈。

1.2 主要試劑 RNAprep prue Plant Kit提取試劑盒購自天根生化科技有限公司、TRNzol總RNA提取試劑購自天根生化科技有限公司。

CTAB提取緩沖液:2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0;2.0 mol/L NaCl;2%PVP，β-巰基乙醇 (使用時加入)。4 mol/L KAc，8 mol/L LiCl，DEPC水，無水乙醇，異丙醇，三氯甲烷，ddH2O。

1.3 桑葉片總RNA的提取

1.3.1 Trizol法 參照天根公司TRNzol總RNA提取試劑說明書進(jìn)行。取0.1 g新鮮桑葉片放入研缽中，加入液氮迅速將其磨成粉末，立即轉(zhuǎn)入已裝有1 mL Trizol試液的EP管中，蓋上蓋子，高速震蕩2 min，室溫靜置5 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心移取上清液至新的EP管中;加入200 μL三氯甲烷，用力振蕩2 min，室溫靜置后分層，4℃、12 000 r/min離心5 min，小心移取上清液至新的EP管中;加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，使RNA沉淀，放入－20℃冰箱1 h;4℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用75%乙醇漂洗3次，4℃、12 000 r/min離心 5 min棄去上清，晾干;加入 40 μL RNase-free水溶解，所得RNA溶液置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CTAB法 提取緩沖液使用前加入β-巰基乙醇至最終濃度為2.0%，將其預(yù)熱至60℃。取0.1 g桑葉置于研缽中，將預(yù)熱的緩沖液加入研缽中，充分研磨至糊狀;用移液槍頭將糊狀物全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，充分振搖，于60℃水浴中加熱約20 min，期間每間隔5 min振搖一次;將EP管于4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于新的EP管中，每管加入等體積水飽和酚-三氯甲烷-異丙醇 (25∶24∶1)，輕輕顛倒混勻，置于冰上10 min;4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清于新的EP管中，加入1/10體積4 mol/L KAc(pH值4.8)、1/10體積無水乙醇，輕輕顛倒混勻后，加入等體積的三氯甲烷-異丙醇(24∶1)，混勻，冰上放置10 min;4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液于新的EP管中，加入1/3體積的LiCl(8 mol/L)，使LiCl終濃度為2 mol/L;4℃放置6 h，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，接著進(jìn)行2次LiCl沉淀操作;沉淀用70%乙醇漂洗2次，晾干RNA，加入40 μL RNase-free水溶解，所得RNA溶液置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RNA提取試劑盒法 參照天根公司RNAprep prue Plant Kit提取試劑盒說明書進(jìn)行。取0.1 g桑葉在研缽中用液氮迅速研磨成粉末，將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，加入450 μL裂解液 (RL)，渦旋震蕩混勻;將EP管中所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱 CS上 (過濾柱 CS放在收集管中)，12 000 r/min離心5 min，小心吸取收集管中的上清液至RNase-free的EP管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的cell碎片沉淀;緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中;向CR3中加入350 μL去蛋白液RW，12 000 r/min離心1 min，倒掉廢液;向吸附柱CR3中加入80 μL DNaseⅠ儲存液，室溫放置15 min;向CR3中加入350 μL去蛋白液RW，12 000 r/min離心1 min，倒掉廢液;向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心1 min倒掉廢液，將吸附柱CR3中加入收集管中;重復(fù)上一步驟，12 000 r/min離心2 min倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液;將吸附柱CR3放入一個新的RNase-free的EP管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加40 μL RNase-free水，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，所得RNA溶液置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 桑葉片總RNA的質(zhì)量檢測

1.4.1 總RNA的完整性檢測 分別取2 μL不同提取方法得到的RNA樣品，在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。90 V恒壓20 min，凝膠成像儀成像，紫外燈下觀察RNA條帶，并照相記錄。

1.4.2 總RNA的純度與產(chǎn)率檢測 將用3種方法提取的RNA分別取1 μL用滅菌的DEPC水稀釋50倍，用紫外檢測儀分別測定260 nm、230 nm和280 nm下的紫外吸光度A260、A230和A280，計算A260/A230、A260/A280，并計算其產(chǎn)率。RNA產(chǎn)率 (μg/g)=A260×40(μg/mL) ×稀釋倍數(shù) ×RNA原液體積 (mL)/所取樣品質(zhì)量 (g)

1.4.3 RT-PCR檢測

1.4.3.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行如下操作:將模板RNA在冰上解凍;隨機(jī)引物Random、10×RT mix、dNTP混合液、RNase-free水在室溫解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體，按照以下步驟配制混合液:2 μL 10 × RT mix，2 μL dNTP 混合液，2 μL Random，8 μL RNase-free水，將5 μL模板RNA加入到混合液中，徹底混勻，渦旋振蕩時間不超過5 s，簡短離心以收集管壁殘留的液體;37℃孵育60 min。

1.4.3.2 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系為20 μL:2 μL cDNA模板、1 μL上游特異性引物 P1:5'-GTC CGA GAC GAA GAC GAG-3'、1 μL下游特異性引物 P2:5'-CTT GTA CAT CTC GGT GTA-3'、6 μL ddH2O、10 μL Taq PCRMaster Mix。反應(yīng)條件為:95℃、5 min;94℃、55 s，52℃、55 s，60℃、1 min，30個循環(huán);60℃、10 min，4℃保存。將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取桑葉片總RNA的完整性 凝膠電泳分析是檢驗RNA質(zhì)量的一種重要手段，從凝膠上可以判斷所得的RNA的完整性和降解程度。經(jīng)過電泳分析，用3種不同提取方法得到的RNA在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種方法提取的桑葉片總RNA凝膠電泳檢測結(jié)果

由圖1可以看出圖譜b由CTAB法提取的RNA，5S、18S、28S 3條帶，其熒光亮度相近且較弱，存在拖尾現(xiàn)象，表明RNA嚴(yán)重降解，點樣孔內(nèi)有亮斑，說明該方法提取得到的RNA中有DNA或蛋白質(zhì)污染。

圖譜c由RNA提取試劑盒法得到的RNA 3條帶較淡，濃度較低，亦存在拖尾現(xiàn)象，說明此方法提取的RNA降解比較嚴(yán)重。

圖譜a由Trizol法提取得到的RNA能看見清晰的3條帶，28S和18S的熒光亮度接近2∶1．條帶之間清晰無彌散現(xiàn)象，說明RNA的完整性較好，未發(fā)生降解，且加樣孔內(nèi)干凈，表明無蛋白或DNA等污染，在28S上方無其他條帶存在，可看出這種方法得到的RNA去除DNA較其他兩種方法徹底。

2.2 不同方法提取桑葉片總RNA的純度和產(chǎn)率 采用紫外分光光度法能夠檢測出總RNA的純度和產(chǎn)率。RNA的A260/A280為1.9～2.1，可認(rèn)為RNA的純度較好;A260/A280值小于1.8，表明蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多;A260/A280值大于2.2，表明RNA已經(jīng)降解。A260/A230值小于2.0，表明裂解液中有異硫氰酸胍或β-巰基乙醇的殘留。3種方法提取桑葉片總RNA的純度和產(chǎn)率見表1。

表1 不同方法提取桑葉片RNA的純度與產(chǎn)率比較

2.3 RT-PCR反應(yīng) RT-PCR是由反轉(zhuǎn)錄PCR和實時PCR共同構(gòu)成的，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。根據(jù)桑科植物的保守序列設(shè)計出一系列的引物，并且通過反復(fù)的試驗篩選出一對特異性引物P1:5'-GTC CGA GAC GAA GAC GAG-3'、P2:5'-CTT GTA CAT CTC GGT GTA-3'分別與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，片段介于500～750 bp，帶型清晰。由此結(jié)果可表明，獲得的RNA可應(yīng)用于RT-PCR反應(yīng)等以RNA為基礎(chǔ)的研究分析。

圖2 桑葉片總RNA RT-PCR電泳檢測結(jié)果

3 討論

從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進(jìn)行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。本試驗通過對幾種不同方法對桑葉片總RNA進(jìn)行提取，找出一種簡單、快速、高效且適合提取桑葉片總RNA的提取方法，為后續(xù)的實驗研究提供了理論和技術(shù)支持。

桑葉片組織中含有豐富的黃酮類成分，它們是桑葉抗氧化、預(yù)防動脈硬化等功能的活性物質(zhì)。黃酮類屬多酚類物質(zhì)，在細(xì)胞破碎時，在多酚氧化酶作用下被氧化成有色的醌類物質(zhì)，從而影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，故常見的阻止酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化的措施是加入PVP和β-巰基乙醇。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時將酚從核酸成分中游離，且PVP和β-巰基乙醇可以作為強(qiáng)還原劑防止多酚氧化，還能破壞多酚氧化酶的二硫鍵從而使其失去活性，有效地防止其與RNA的結(jié)合［11］。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。桑葉中的多糖較多且成分比較復(fù)雜。而多糖是影響RNA提取的一個難題，因為多糖在水中的理化性質(zhì)與RNA較相似，在提取時多糖常與RNA形成難溶的物質(zhì)共同沉淀下來，而常規(guī)的RNA提取方法很難將它們兩者有效的分開，且在除去多糖的同時也會帶走部分的RNA，造成RNA的產(chǎn)量大大下降［12］。由于多糖會抑制許多酶的活性，所以被多糖污染的RNA樣品不能用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究試驗。在桑葉RNA提取過程中，蛋白質(zhì)對樣品的污染也是一個重要因素，因而要獲得高質(zhì)量的RNA就要盡可能的除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。RNase即RNA水解酶，是一種核酸內(nèi)切酶，對RNA有水解作用，但對DNA不起作用。RNase非常穩(wěn)定，在試驗過程中，無論內(nèi)源RNase還是外源RNase都會使提取的RNA發(fā)生降解，因此，它是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)，給實驗帶來一定的困難。綜上所述，在提取RNA的過程中必須要控制RNase的活性及次生代謝產(chǎn)物對其的干擾，從而得到高質(zhì)量、高純度的RNA。

本實驗中的RNAprep prue Plant Kit提取試劑盒法中的胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白質(zhì)的變性劑在實驗的過程中可抑制RNase的活性，保護(hù)RNA不被降解。CTAB法中的CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。而Trizol法采用異硫氰酸胍使核蛋白復(fù)合體解離，同時將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚-三氯甲烷混合液抽提的方法，低pH值的酚可以使RNA進(jìn)入到水相中，而蛋白質(zhì)和DNA則留在有機(jī)相中，方便完成后續(xù)的RNA提取。通過試驗結(jié)果可以看出試劑盒法和CTAB法提取的桑葉片的RNA產(chǎn)率較低且質(zhì)量并不好，不能用于后續(xù)的實驗研究，而Trizol法提取時間較短、操作簡單易行、重復(fù)性好，產(chǎn)率高且質(zhì)量好，可用于后續(xù)的實驗，故Trizol法是提取桑葉片中總RNA的一種較好的方法。

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