基于抗氧化活性測(cè)定的山藥品質(zhì)評(píng)價(jià)新方法

李寒冰， 齊向云， 李根林*， 陳 磊

(1.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008;2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州廣東510006)

相對(duì)于化學(xué)藥，中藥成分復(fù)雜、藥理活性廣泛，單一指標(biāo)性成分定量測(cè)定難以全面反映其內(nèi)在品質(zhì)，而中藥指紋圖譜也只是反映中藥的化學(xué)信息，難以直接體現(xiàn)其藥效信息［1-4］。此外，囿于現(xiàn)有分析分離手段、成分的穩(wěn)定性、對(duì)照品等因素的制約，當(dāng)前仍然有一部分中藥品種不能以指標(biāo)性成分定性/定量分析進(jìn)行質(zhì)量控制。 《中國(guó)藥典》2010年版編制大綱明確指出，要建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，逐步由單一指標(biāo)性成分定性定量向活性、有效成分及生物測(cè)定的綜合檢測(cè)過(guò)渡，向多成分及和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化，由此而制定的“中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則”已被《中國(guó)藥典》2010年版 (一部)附錄收載。本研究選用傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥山藥為示范，探索性開(kāi)展了與“補(bǔ)益”藥效相關(guān)的生物活性檢定方法的研究。

山藥Dioscoreae Rhizoma為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb.的干燥根莖，品系繁多藥材品質(zhì)差異性較大，且成分復(fù)雜、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，當(dāng)前《中國(guó)藥典》并未收載有效成分 (或指標(biāo)性成分)的定量測(cè)定法對(duì)山藥進(jìn)行質(zhì)量控制［5］。本研究首次探索建立以藥效為基礎(chǔ)的山藥品質(zhì)生物學(xué)評(píng)價(jià)方法，作為中國(guó)藥典常規(guī)和化學(xué)測(cè)定的補(bǔ)充與提高，旨在從多重角度共同把關(guān)山藥內(nèi)在質(zhì)量，完善現(xiàn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)，并能為其它藥效物質(zhì)不明確的補(bǔ)益類中藥質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究提供新的思路和參考。

藥理研究表明山藥具有抗衰老、抗糖尿病、抗腫瘤等藥理作用［6-7］，從中醫(yī)角度看這些疾病以及機(jī)體的衰老的進(jìn)程中往往呈現(xiàn)出腎虛癥狀，而這些病變與體內(nèi)自由基積累有很大關(guān)系［8］;山藥是常用的“補(bǔ)腎”中藥［5］，臨床常用于對(duì)上述疾病的治療與預(yù)防往往取得較好療效;且山藥中的多糖、不飽和脂肪酸、多酚等本身都是天然的抗氧化劑。目前抗氧化活性被認(rèn)為是山藥“補(bǔ)益”作用機(jī)制之一［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)從抗氧化活性方面探討建立山藥的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器 SZ—93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠;BS210S型分析天平，北京賽多麗斯天平有限公司;KQ—100型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;80—2型離心沉淀機(jī)，鞏義市英峪予華儀器廠;SHZ—D(Ⅲ)型豫華牌循環(huán)真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠;UV1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;移液槍 (500 μL)，上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.1.2 材料與試劑 編號(hào)為1～13號(hào)的山藥樣品分別購(gòu)自河南鄭州市的藥店和中藥材批發(fā)市場(chǎng)，隨機(jī)編號(hào)，編號(hào)為14～23號(hào)的山藥飲片由河南中醫(yī)學(xué)院中藥炮制實(shí)驗(yàn)室利用新鮮山藥 (購(gòu)自鄭州市5家鐵棍山藥專店)的根莖，按照《中國(guó)藥典》2010年版收載的標(biāo)準(zhǔn)制備而成，實(shí)驗(yàn)所用山藥樣品經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陳隨清教授鑒定，均為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb.的干燥或新鮮根莖;維生素E膠丸 (國(guó)藥準(zhǔn)字H20043134，批號(hào):001008)，青島雙鯨藥業(yè)有限公司。

DPPH·試劑，美國(guó)Sigma公司;無(wú)水乙醇 (分析純)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;雙蒸餾水 (新鮮，自制)。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 取山藥樣品粉碎，過(guò)40目篩。取3 g粉末，精密稱量，置干燥錐形瓶，加10倍量75%乙醇 (體積分?jǐn)?shù)，下同)超聲提取30 min，真空抽濾，棄殘?jiān)瑩]干溶媒，干燥提取物用30 mL 75%乙醇溶解，制成供試品溶液。置冰箱冷藏室 (0～4℃)保存，備用。

1.2.2 工作對(duì)照品溶液的制備 取1～13號(hào)山藥樣品等質(zhì)量混合，粉碎，過(guò)40目篩。其溶液制備方法同1.2.1項(xiàng)下。

1.2.3 陽(yáng)性對(duì)照品溶液的制備［10-12］取維生素 E膠丸(100 mg/粒)4粒，剪破膠丸殼，用20 mL無(wú)水乙醇溶解，所得維生素E溶液質(zhì)量濃度為20 mg/mL，作為本次試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照品。

1.2.4 DPPH·自由基溶液的制備 精密稱取0.04 g DPPH·自由基，用無(wú)水乙醇溶解，移至500 mL量瓶定容，所得DPPH·溶液的濃度為20 mmol/mL，置冰箱 (0～4)℃避光保存，備用。

1.2.5 加樣與檢測(cè)［13-14］取樣品溶液，以0.7劑距配制成9組，分別按表1加樣于離心試管中，充分混勻，室溫下避光、靜置反應(yīng)30 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 (A)。每一吸光值平行測(cè)3次，取其平均值 (注意進(jìn)行校正吸光度)。清除率按下列公式計(jì)算:

表1 加樣方法與加樣量

1.2.6 IC50的選擇和效價(jià)的測(cè)定 由1.2.5項(xiàng)下測(cè)定的結(jié)果，利用Reed Muench法求出工作對(duì)照品和10批山藥樣品試液的IC50，以IC50臨近的4個(gè)質(zhì)量濃度梯度測(cè)定各山藥試液的DPPH·清除率，計(jì)算其效價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)中暫時(shí)以1～13號(hào)山藥樣品均勻混合物的75%乙醇提取物作為山藥效價(jià)測(cè)定時(shí)的工作對(duì)照品，為方便計(jì)算，約定本工作對(duì)照品的效價(jià) (PS)為100.0 U/mg。按照生物檢定量反應(yīng)平行線法 (2·2)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依1.2.5項(xiàng)的步驟進(jìn)行加樣與檢測(cè)，對(duì)不同批次樣品與工作對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比檢定，結(jié)果采用《中國(guó)藥典》生物檢定程序BS2000進(jìn)行效價(jià)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 山藥抗氧化活性檢測(cè)和量效關(guān)系考察 陽(yáng)性對(duì)照藥維生素E的IC50為5.73 mg/mL，山藥工作對(duì)照品S的IC50為3.81 mg/mL(生藥質(zhì)量濃度，下同)，樣品6的 IC50為10.35 mg/mL，三者量-效曲線形狀基本相同 (見(jiàn)圖1)，自由基清除率與對(duì)數(shù)劑量的自然對(duì)數(shù)值之間呈良好的對(duì)稱“S”形曲線 (見(jiàn)圖2)，提示山藥與維生素E的抗氧化作用趨勢(shì)在一定范圍內(nèi)基本相同。

圖1 山藥的抗氧化活性量-效曲線圖

圖2 山藥的抗氧化活性量-效對(duì)數(shù)曲線圖

2.2 線性關(guān)系考察 以工作對(duì)照品S和6號(hào)樣品考察結(jié)果為例:工作對(duì)照品線性方程為y=38.658ln(x)-39.057，R=0.990 00，在2.11～12.53 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，顯示了良好的線性關(guān)系;6號(hào)樣品線性方程為y=35.076ln(x)-4.781 2，R=0.990 2，在4.15～24.69 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系 (見(jiàn)圖3)。說(shuō)明此反應(yīng)類型在一定范圍內(nèi)適合用生物檢定中“量反應(yīng)平行線測(cè)定”法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

圖3 山藥抗氧化活性的線性考察

2.3 效價(jià)計(jì)算

2.3.1 可靠性檢驗(yàn) 6號(hào)樣品可靠性檢驗(yàn)結(jié)果分析:試品間差異不顯著 (P＞0.05)，說(shuō)明供試品和工作參照物效價(jià)無(wú)明顯差別。回歸項(xiàng)差異顯著 (P＜0.01)，說(shuō)明隨著質(zhì)量濃度的降低自由基清除率值有規(guī)律地降低;同劑間差異有顯著意義 (P＜0.01)，說(shuō)明試驗(yàn)計(jì)量比例和試驗(yàn)安排合理。偏離平行線的差異無(wú)顯著意義 (P＞0.05)，說(shuō)明S和T呈平行直線關(guān)系，所測(cè)得結(jié)果有效 (見(jiàn)表2)。

表2 6號(hào)山藥樣品生物效價(jià) (2·2)法測(cè)定的可靠性檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 效價(jià)與可信限 以6號(hào)樣品為例，測(cè)得效價(jià)PT=0.175 37 U/mL，效價(jià)的可信限率為 FL=8.893 7%，即該樣品效價(jià)在0.154 09～0.185 29 U/mL范圍內(nèi)是可信的。

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與分析 編號(hào)為1～13號(hào)的樣品分別購(gòu)自河南鄭州市兩家藥店和鄭州市中藥材批發(fā)市場(chǎng)，測(cè)得其抗氧化效價(jià)差別顯著，表明該方法可以對(duì)不同來(lái)源、批次及儲(chǔ)藏管理等條件下的山藥進(jìn)行區(qū)分，也提示這些山藥批次間品質(zhì)存在差異。14～23號(hào)樣品為本實(shí)驗(yàn)室采用新鮮山藥自制的飲片，偶數(shù)號(hào)與相鄰的奇數(shù)號(hào)來(lái)源于同一批次新鮮樣品 (如14與15號(hào)是由同一批山藥新鮮根莖制備而成，其余類推);14、16、18、20、22號(hào)樣品為除去外皮的山藥;15、17、19、21、23號(hào)樣品為具皮山藥。14～23號(hào)結(jié)果顯示帶皮山藥飲片效價(jià)明顯高于去皮飲片。編號(hào)24為工作對(duì)照品 (見(jiàn)圖4)。

圖4 23批山藥飲片抗氧化活性效價(jià)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 取同一編號(hào)相同質(zhì)量濃度的山藥供試品溶液5份，求得自由基清除率分別為56.83%、57.55%、57.74%、56.44%、56.00%，RSD值為1.29%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性 用同一編號(hào)的山藥樣品粉末5等份，分別依1.2.1項(xiàng)的步驟制成供試品溶液，按1.2.5項(xiàng)和1.2.6項(xiàng)的步驟計(jì)算效價(jià)，5次測(cè)得結(jié)果依次為0.79、0.84、0.81、0.76、0.76 U/mg，RSD值為4.31%，表明該方法具有較好重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性 用同一編號(hào)相同濃度供試品溶液分作5份，分別于0、2、4、6、8 h后加DPPH·反應(yīng)，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，5次測(cè)得效價(jià)依次為0.75、0.79、0.84、0.85、0.81 U/mg，RSD值為4.98%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3 討論

山藥的補(bǔ)益作用與其抗氧化活性密切相關(guān)。現(xiàn)有的山藥抗氧化活性測(cè)定方法往往涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及較復(fù)雜的生化檢測(cè)，多數(shù)存在步驟繁瑣、重復(fù)性差、試驗(yàn)成本高等局限性，不適宜用于山藥質(zhì)量的生物測(cè)定。DPPH·法具有簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是公認(rèn)度高的體外抗氧化測(cè)定方法之一。本研究采用DPPH·測(cè)定法測(cè)定山藥的抗氧化活性初步得到比較滿意的效果。

從某種意義上來(lái)講，中藥生物活性測(cè)定與化學(xué)成分含有量測(cè)定相比，更具有優(yōu)勢(shì)，它反映了中藥的整體效應(yīng)，符合中醫(yī)藥的整體觀［15］。理論上多數(shù)藥理方法通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)均可用作生物測(cè)定方法，但由于藥品檢驗(yàn)工作對(duì)生物測(cè)定的要求有其特殊性，以及多數(shù)中藥量效關(guān)系不明顯，一般的藥理方法并不適合作為生物檢定方法，故應(yīng)當(dāng)對(duì)生物活性檢測(cè)方法進(jìn)行篩選、優(yōu)化和選擇。本研究所建立方法在藥效相關(guān)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)兼顧了檢驗(yàn)方法的“重復(fù)、靈敏、快捷、易量化、經(jīng)濟(jì)安全”等原則［16］，以便于推廣與應(yīng)用。

生物效價(jià)測(cè)定方法所使用的對(duì)照品是保證其準(zhǔn)確性與可靠性的重要基礎(chǔ)之一，所以應(yīng)選用有“同質(zhì)”或“基本同質(zhì)”的參照物 (對(duì)照品)，以測(cè)定供試品的相對(duì)效價(jià)［17］。由于中藥質(zhì)量的生物活性測(cè)定是近年來(lái)提出的新型中藥質(zhì)量控制方法，對(duì)于對(duì)照品的制備或選用“中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則”等尚未有明確規(guī)定。中藥定量測(cè)定采用的對(duì)照品是高純度單體化合物，由于中藥具有多成分、作用多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)等特點(diǎn)，對(duì)照品純度越高，可能反而越不能代表中藥的內(nèi)在品質(zhì)。中藥生物效價(jià)測(cè)定用的對(duì)照品的選擇應(yīng)以“有代表性的混合體”作為參照物，對(duì)此本課題組有專門報(bào)道［18］?；谏鲜隹紤]，本實(shí)驗(yàn)暫定以多批樣品的混合物制備成工作對(duì)照品以供方法學(xué)研究之用，有待于在后續(xù)研究中對(duì)“對(duì)照品”進(jìn)行專門的規(guī)范化研究。

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