不同月份肉豆蔻葉片揮發(fā)油成分分析

趙祥升， 黃立標(biāo)， 歐淑玲， 馮錦東

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533)

肉豆蔻Myristica fragrans Houtt為肉豆蔻科植物，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞、西印度群島、巴西等地，我國(guó)海南、云南、廣東、臺(tái)灣等地也有栽培。肉豆蔻種仁為傳統(tǒng)中藥，性溫，味辛、微苦，具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效，用于脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛、食少嘔吐等癥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明有較強(qiáng)的抗菌消炎、鎮(zhèn)痛等功效［1］。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS)技術(shù)是植物揮發(fā)性成分研究的常用分析手段［2］，前人對(duì)肉豆蔻種仁的揮發(fā)油成分的GC-MS分析已有報(bào)道，主要成分為:單萜、倍半萜和芳香類物質(zhì)［3-4］。但有關(guān)肉豆蔻葉片揮發(fā)油成分的分析，特別是其動(dòng)態(tài)的變化鮮有報(bào)道，前期的工作中對(duì)肉豆蔻葉片中主要成分的動(dòng)態(tài)變化做了研究［5-6］，葉片中含油量、α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜烯醇3種成分不同月份相對(duì)含有量有一定的變化。

本實(shí)驗(yàn)主要是利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同月份肉豆蔻葉片揮發(fā)油成分進(jìn)行檢測(cè)，定性、定量分析主要成分，考察相對(duì)含有量隨季節(jié)變化的趨勢(shì);同時(shí)利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004版)軟件比較不同月份揮發(fā)油的相似度，以期對(duì)肉豆蔻葉片的藥用價(jià)值，開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Agilent5973-6890氣質(zhì)聯(lián)用儀;Mili-Q純水儀，中藥粉碎機(jī);無水硫酸鈉，乙醚為分析純;肉豆蔻1986年引種至海南省興隆南藥園，每月分別采雌、雄株葉片適量，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所陳偉平研究員鑒定為肉豆蔻Myristica fragrans Houtt的葉片，采樣時(shí)間見表1。

表1 采樣時(shí)間Tab.1 Sampling time

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取與樣品制備 取肉豆蔻葉片，按照2010年版《中國(guó)藥典》附錄XD方法提取揮發(fā)油，葉片為鮮葉，提取工藝為:純水浸泡2 h，料液比1∶10，提取8 h。揮發(fā)油加適量無水硫酸鈉脫水，揮發(fā)油為淡黃色，收率為雄株葉片為(0.47±0.3)% (g/g)，雌株葉片為 (0.41±0.2)%(g/g)。取揮發(fā)油適量，乙醚為溶劑，過0.45 μm有機(jī)濾膜，備用。

1.2.2 質(zhì)譜條件 HP-5MS毛細(xì)管柱 (0.25 mm×30 m，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度240℃，升溫程序?yàn)槌鯗?0℃，以5℃/min升溫到280℃;載氣為高純氦氣，流量1 uL/min，進(jìn)樣量1μL，分流比30∶1，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250℃。EI電離源，70 ev，離子源溫度230℃，柱前壓5.10×104Pa，掃描范圍 (m/z):35～550。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 不同月份葉片揮發(fā)油的色譜數(shù)據(jù)由中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)比較其相似性;分別取1、3、5、7、9、11月份雌、雄株揮發(fā)油在上述的GC-MS條件下分析，所得質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)處理和NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索，確定化合物，按峰面積歸一法計(jì)算樣品中各化合物在揮發(fā)油中的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月份揮發(fā)油相似度比較 在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明色譜儀的精密度，重復(fù)性，系統(tǒng)適用性較好。將不同月份肉豆蔻揮發(fā)油的色譜輸數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，12個(gè)月份的揮發(fā)油中共有25個(gè)共有峰 (見圖1)，各個(gè)峰的相對(duì)含有量以及樣品的相似度見表2。25個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD均小于0.07%，說明樣品的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好，但是通過相對(duì)含有量的RSD可知，不同月份的揮發(fā)油中各個(gè)峰有一定的變化。由表2可知:共有峰14不同月份相對(duì)含有量的RSD為106.14%，該成分在7、8月的相對(duì)含有量最高，其他月份明顯較低，其他峰在不同月份的相對(duì)含有量的變化較小。由相似度分析可知12個(gè)樣品的相似度均在0.900以上，說明了樣品的一致性較好。相似度的差異可能是由不同月份揮發(fā)油中成分相對(duì)含有量的變化引起。

圖1 1月份葉片揮發(fā)油的色譜圖Fig.1 Chromatogram of volatile oil in leaves from January

2.2 葉片揮發(fā)油成分分析 在上述GC-MS條件下，取單月肉豆蔻雌、雄株葉片的揮發(fā)油適量，乙醚溶解進(jìn)樣，樣品總離子流圖 (見圖2)經(jīng)質(zhì)譜掃描后，經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)檢索確定其揮發(fā)油的成分，按照峰面積歸一法計(jì)算揮發(fā)油中各組分的相對(duì)含有量。肉豆蔻雌雄株葉片中揮發(fā)油的主要成分為單萜類成分，每個(gè)樣品中單萜類物質(zhì)占該樣品成分總數(shù)的46.67%～50.00%之間;其次為倍半萜類成分，相對(duì)含有量在34.09%～44.18%之間。此外葉片中還含有芳香類物質(zhì)、二萜等成分。葉片中相對(duì)含有量較高的成分主要是:α-蒎烯 (9.10% ～20.10%)、β-蒎 烯 (5.53% ～19.64%)、4-萜品醇(9.93% ～ 13.58%)、γ-松油烯 (3.32%～7.50%)、肉豆蔻醚 (1.30%～11.24%)、α-水芹烯 (1.16% ～3.31%)、3-蒈烯(0.21%～4.44%)、α-松油醇(2.12%～3.75%)等。Madhavan［7］研究的肉豆蔻葉油中主要成分為:α-蒎烯，檜烯，苧烯等;陳迪華等［8］研究表明葉油中主要成分為 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、肉豆蔻醚與本結(jié)果相似但含有量有差異。Lavanya在對(duì)雌雄株的研究中顯示雄株和雌株的GC圖譜沒有區(qū)別，雌株葉油中肉豆蔻醚和欖香素的含有量顯著低于雄株葉油，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同。此外表-雙環(huán)倍半水芹烯、α-紫穗槐烯、β-律草烯、葉綠醇等物質(zhì)第一次從肉豆蔻葉片中分離得到。

表2 不同月份葉片揮發(fā)油中共有峰的相對(duì)含有量、相似度Tab.2 Relative contents of common peaks and similarity of volatile oil from leaves in different months

圖2 3月份雌雄株揮發(fā)油總離子流圖Fig.2 Total ion currents of volatile oil from leaves of male and female in March

2.3 主要成分?jǐn)?shù)量的變化 根據(jù)GC-MS檢測(cè)的結(jié)果，肉豆蔻1、3、5、7、9、11月份雌雄株葉片揮發(fā)油成分相對(duì)含有量大于0.1%的物質(zhì)數(shù)量隨月份變化見圖3。有圖可知，主要成分?jǐn)?shù)量的變化在前幾個(gè)月的變化不大，但在11月份雌株中成分的數(shù)量明顯低于雄株。10、11月是海南肉豆蔻收獲的季節(jié)，果仁積累物質(zhì)的重要時(shí)期，物質(zhì)貯存向果仁轉(zhuǎn)變，也可能與合成酶的活性有關(guān)，因此雌株中含量的物質(zhì)發(fā)生了減少。

圖3 主要成分 (＞0.1%)數(shù)量變化Fig.3 Variation of the number of the main components(＞0.1%)

表3 肉豆蔻葉片揮發(fā)油中主要成分Tab.3 Main components of volatile oil from leaves of Myristica fragrans Houtt

續(xù)表3

續(xù)表3

2.4 主要成分含有量變化 肉豆蔻葉片中含有量最高的為α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜品醇，但3種成分的動(dòng)態(tài)變化已有報(bào)道。在此選擇具有肉豆蔻特征性成分:γ-松油烯、3-蒈烯、α-水芹烯、異丁香酚和肉豆蔻醚，觀察動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。由圖4可知5種成分中變化幅度最大的為肉豆蔻醚，雌株葉片中7月份含有量最高達(dá)到10.25%，1月最低僅為1.30%;雄株中3月份含有量最高:11.24%，7月最低:1.68%。其他幾種成分的變化幅度相對(duì)較小，異丁香酚和α-水芹烯相對(duì)含有量比較穩(wěn)定。3-蒈烯的變化幅度也較大，雌株1、3月含有量最低0.21%、0.87%;雄株5月含有量最低:0.15%，但值得注意的是在3-蒈烯相對(duì)含有量最低的樣品中2-蒈烯的含有量相對(duì)較高;說明兩者之間在植物體內(nèi)有異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化的可能性。

圖4 5種成分的變化趨勢(shì)Fig.4 Trends of contents of five components

3 討論

肉豆蔻葉片揮發(fā)油中萜類成分與前人研究的種仁中的差異不大，肉豆蔻中的活性物質(zhì)如:肉豆蔻醚、欖香素、丁香酚、異丁香酚和黃樟腦等在葉片中都檢測(cè)到，但含有量與前人研究的有差異。王瑩對(duì)商品肉豆蔻中揮發(fā)油分析中肉豆蔻醚、欖香素、丁香酚的含有量 (最小值)分別為:37.63%、1.77%、0.4%均高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，異丁香酚的含有量差異不大;Muchtaridi等［9］測(cè)得肉豆蔻種仁揮發(fā)油中這幾種成分的含有量也均高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。肉豆蔻中的這幾個(gè)成分既是活性物質(zhì)也是有毒物質(zhì)，肉豆蔻醚和欖香素即是抗氧化的有效成分［10］，也是致幻［11］的毒性物質(zhì)，也有研究表明丁香酚也可能會(huì)提高致幻作用［12］，這些成分在食品、調(diào)味品中的添加量上也做了明確的限制［13］，因此肉豆蔻資源在開發(fā)利用中要慎重。

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)肉豆蔻雌株揮發(fā)油的含有量高于雄株，雌株在4、10月的含油量最高，雄株呈現(xiàn)先升高再降低最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在對(duì)雌雄株中含有量大于0.1%成分的數(shù)量上的比較中兩者沒有差異，化合物中單萜類，倍半萜成分的比例差異不大，通過樣雌雄株的樣品的GC圖譜的相似度比較可以確定肉豆蔻雌雄株葉片揮發(fā)油成分差異不大。但是雌株葉片中肉豆蔻醚和欖香素的含有量顯著低于雄株葉油，而前人在對(duì)肉豆蔻種仁揮發(fā)油的的GC-MS分析中:肉豆蔻醚和欖香素的含有量都相當(dāng)?shù)母撸?，9］。兩化合物在雌雄株中含有量的差異性的原因還有待進(jìn)一步研究。

肉豆蔻在海南引種栽培已有研究，在對(duì)其氣候適應(yīng)性分析表明海南有較大面積適宜該物種的栽培［14］。肉豆蔻葉片成分比較研究對(duì)其資源的利用，葉片揮發(fā)油質(zhì)量控制，化學(xué)成分指紋圖譜的制定提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)對(duì)肉豆蔻規(guī)范化種植，資源開發(fā)都有重要意義。

［1］《中華本草》編輯委員會(huì).中華本草:第七卷〔M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1999:1599.

［2］回瑞華，侯冬巖，劉曉媛，等.不同方法提取側(cè)柏葉片中揮發(fā)油成分的氣相色譜法-質(zhì)譜分析［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2006，27(4):226.

［3］王 瑩，楊秀偉，陶海燕，等.商品肉豆蔻揮發(fā)油成分的GC-MS分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(4):339-342.

［4］王 瑩，楊秀偉.印度尼西亞產(chǎn)肉豆蔻揮發(fā)油成分的GC-MS分析［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(9):603-606.

［5］黃立標(biāo)，馮錦東，王德立，等.海南產(chǎn)肉豆蔻葉揮發(fā)油及其主要成分動(dòng)態(tài)變化研究［J］.中成藥，2010，32(12):2126-2130.

［6］王德立，馮錦東，黃立標(biāo)，等.海南產(chǎn)肉豆蔻葉揮發(fā)油中α-蒎烯與β-蒎烯含量動(dòng)態(tài)變化［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(12):3097-3098.

［7］Madhavan L.The chemical composition of leaf and flower of Myristica fragrans houtt［J］.Indian Perfum，1991，35(3):17-19.

［8］陳迪華，常 琪，馮錦東.海南島引種與馬來西亞進(jìn)口肉豆蔻(種子和葉)揮發(fā)油的比較研究［J］.中藥通報(bào)，1987，12(10):11-13.

［9］Muchtaridi，Anas Subarnas，Anton Apriyantono，et al.Identification of compounds in the essential oil of nutmeg seeds(Myristica fragrans houtt.)that inhibit locomotor activity in mice［J］.Int J Mol Sci.2010，11:4771-4781.

［10］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1977:984-985.

［11］楊秀偉.中藥成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性與藥效［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2006:154.

［12］梅 欣.植物藥數(shù)據(jù)庫(kù)·肉豆蔻［J］.國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè)，2007，22(5):227.

［13］弓 寶，馮錦東，黃立標(biāo)，等.肉豆蔻精油的安全性研究進(jìn)展［J］.香精香料化妝品，2010，12(6):39-41.

［14］譚業(yè)華，陳 珍.肉豆蔻在海南擴(kuò)種栽培的氣候適應(yīng)性分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(34):11119-11120.