高效液相色譜法測定復(fù)方昆丹膠囊中6種主要成分

陳 婷， 趙瑞芝， 黎 雄， 黃 斌， 朱亞珍， 鄭廣娟*

(1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510006;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006)

代謝綜合征 (metabolic syndrome)是以胰島素抵抗 (insulin resistance)為中心環(huán)節(jié)的一組代謝紊亂性疾病，是各種代謝危險因素在同一個體中聚集的狀態(tài)。近年來，代謝綜合征發(fā)病率逐年遞增，研究表明，我國代謝綜合征患病率已高達(dá)14%～18%，而在糖尿病患者中甚至高達(dá)60% ～80%［1］。

昆丹膠囊由白術(shù)、制首烏等藥物組成，針對代謝綜合征在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，以益氣活血、消濕蠲痰、健脾補(bǔ)腎為治療原則［2］，用于治療高血壓、高血脂、糖尿病、肥胖等代謝綜合征［3-9］。文獻(xiàn)報道中對苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和大黃素甲醚的單一成分或2種成分進(jìn)行HPLC定量測定的方法較多［10-12］，但尚未見同時對6種成分進(jìn)行HPLC定量測定的方法。本實驗采用HPLC法同時測定白芍、佛手、制首烏和白術(shù)的6種有效成分，對控制和提高昆丹膠囊的質(zhì)量具有重要的意義。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998PDA檢測器，METTLER AB135-S電子分析天平，BRANSON 8510超聲清洗儀。

苯甲酰芍藥苷對照品 (天津一方科技有限公司，批號20110315)，5，7-二甲氧基香豆素 (sig-ma公司，批號05398PJ)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ (廣州萬阡源實驗設(shè)備有限公司，批號20101013)，大黃素(廣州市藥品檢驗所，批號110756-200110)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ (廣州萬阡源實驗設(shè)備有限公司，批號20090423)，大黃素甲醚 (廣州市藥品檢驗所，批號110758-201013)甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。昆丹膠囊為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈 (A)-水 (B)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫 (0～6 min，35% ～40%A，6～10 min，40% ～55%A，10～15 min，55% ～65%A，15～26 min，65% ～66%A，26～27 min，66%～70%A);體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃;檢測波長220 nm。

2.2 溶劑的制備

2.2.1 混合對照品的制備 取苯甲酰芍藥苷對照品、5，7-二甲氧基香豆素對照品、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品、大黃素對照品、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品及大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含苯甲酰芍藥苷對照品0.011 0 mg/mL、含5，7-二甲氧基香豆素0.005 7 mg/mL、含白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品0.007 6 mg/mL、含大黃素對照品0.004 7 mg/mL、含白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品0.003 7 mg/mL及含大黃素甲醚對照品0.001 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品制備 取本品適量，精密稱取，置100 mL平底燒瓶中，加入10倍量的75%乙醇浸泡1 h，加熱回流提取1 h，趁熱過濾，殘渣加入8倍量的75%乙醇加熱回流1 h，趁熱過濾，合并提取液，定容至250 mL量瓶中。取10 mL75%乙醇液，水浴蒸干，二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷液，蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按2.2.2項下方法制成分別缺白芍、佛手、白術(shù)和制首烏的4份陰性樣品溶液，在2.1項色譜條件下吸取10 μL進(jìn)樣。結(jié)果表明，陰性樣品圖譜中，在與樣品圖譜中6種被測成分相同位置上無峰出現(xiàn)，表明無陰性干擾。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品，樣品和陰性樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance，sample and negative sample

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別吸取對照品溶液和供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件記錄色譜圖，結(jié)果苯甲酰芍藥苷，5，7-二甲氧基香豆素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，大黃素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，大黃素甲醚的保留時間分別為8、13、16、18、21、28 min左右，陰性對照樣品對測定無干擾，色譜圖見圖1，苯甲酰芍藥苷峰，5，7-二甲氧基香豆素峰，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰，大黃素峰，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ峰，大黃素甲醚峰與鄰近峰達(dá)到基線分離，分離度良好 (R＞1.5)。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL進(jìn)樣，以對照品進(jìn)樣量 (μg)對峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、大黃素甲醚回歸方程分別為:

結(jié)果表明苯甲酰芍藥苷，5，7-二甲氧基香豆素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，大黃素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別在 2.20～22.0 μg/mL，1.13～11.3 μg/mL，1.52 ～ 15.2 μg/mL，0.95 ～ 9.5 μg/mL，0.75 ～ 7.5 μg/mL，0.35 ～ 3.5 μg/mL (r ＞0.999 9)范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、大黃素甲醚混合對照品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、大黃素甲醚對照品RSD(n=6)分別為2.5%、0.4%、0.4%、0.4%、0.6%、0.8%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和大黃素甲醚峰面積的RSD(n=6)分別為 2.0%、0.7%、0.7%、1.9%、1.1%、1.4%。表明供試品溶液中苯甲酰芍藥苷，5，7-二甲氧基香豆素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，大黃素，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和大黃素甲醚在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取6份昆丹膠囊樣品，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果樣品中苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、大黃素甲醚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.086、0.061、0.100、0.064、0.034、0.021 mg/g，RSD分別為 2.5%、1.3%、1.2%、1.9%、1.1%、0.7%。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量的樣品適量，共9份，按對照品加入量為樣品中相應(yīng)成分含有量的80%、100%、120%分別精密加入苯甲酰芍藥苷對照品0.002 3、0.002 9、0.003 5 mg/mL，5，7-二 甲 氧 基 香 豆 素 對 照 品 0.001 6、0.002 1、0.002 5 mg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品0.002 7、0.003 4、0.004 0 mg/mL，大黃素對照品0.001 7、0.002 2、0.002 6 mg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品0.000 9、0.001 2、0.001 4 mg/mL，大黃素甲醚對照品0.000 6、0.000 7、0.000 8 mg/mL，各3份。按上述供試品溶液的制備方法制備，依法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=3)Tab.1 Results of recovery tests(n=3)

2.9 樣品測定 取3個批號的樣品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品中6種成分的測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of sample determination(n=3)

3 討論

3.1 中藥材和中藥復(fù)方成分種類復(fù)雜，研究中常會碰到同時測定多個成分且各成分的紫外吸收不同的問題，本實驗采用220nm為檢測波長［13］，能夠很好的兼顧復(fù)方中各類成分。

3.2 在實驗過程中，曾分別采用乙醇、甲醇超聲提取和乙醇水浴加熱回流，考察提取率，結(jié)果顯示75%乙醇水浴加熱回流提取各成分含有量較高，故確定75%乙醇回流為提取方案，提取省時完全，操作簡單，重現(xiàn)性好。此外，摸索萃取條件時，曾采用正丁醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑，結(jié)果正丁醇、乙酸乙酯得到的有效成分較低，而三氯甲烷和二氯甲烷較佳，但三氯甲烷毒性較大，故采用二氯甲烷代替，效果同等，毒性更小，簡單易操作。

3.3 在流動相的選擇中，采用了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸進(jìn)行梯度洗脫［14］，經(jīng)過實驗分析，綜合考慮了分離效果、基線平穩(wěn)、操作方便性等情況，最終確定乙腈-水為最佳流動相，并摸索了等度、梯度條件［15］，最后確定了本實驗中的梯度系統(tǒng)，苯甲酰芍藥苷、5，7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、大黃素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、大黃素甲醚6種成分出峰快，與雜質(zhì)峰的分離度均達(dá)到1.5以上。

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