大孔樹(shù)脂分離純化青錢(qián)柳總黃酮的工藝研究

酈紅巖，陳 建，趙 雷

江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司，鎮(zhèn)江 212009

青錢(qián)柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljin.]廣泛分布于江西、浙江、江蘇、安徽、福建等地，是我國(guó)特有的速生樹(shù)種。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，青錢(qián)柳有降血壓、降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫力的功效，是一種值得開(kāi)發(fā)的天然資源[1]。青錢(qián)柳中具有豐富的黃酮類(lèi)化合物，如槲皮素、山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖、山奈酚-4′-甲醚-7-O-β-D-甘露糖[2]、兒茶素、南酸棗喬松素-7-O-吡喃葡萄糖苷[3]等。研究表明，青錢(qián)柳黃酮是α-葡萄糖苷酶抑制劑，有很強(qiáng)的抑制活性，能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖[4]。

目前有大量的文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)于黃酮類(lèi)物質(zhì)的純化精制具有良好的效果，已被成功用于多種中草藥中黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離純化[5]。本研究采用水提、大孔樹(shù)脂吸附、解吸來(lái)純化青錢(qián)柳中總黃酮，為青錢(qián)柳的深度開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器、原料與試藥

島津UV-2550紫外分光光度儀；CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）。

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707）；HPD722、HPD100、D101、HPD400、HPD600、HPD427大孔樹(shù)脂 （購(gòu)自滄州寶恩吸附樹(shù)脂材料科技有限公司）。試劑為分析醇；水為蒸餾水。

青錢(qián)柳購(gòu)自福建龍巖地區(qū)，經(jīng)江蘇大學(xué)歐陽(yáng)臻教授鑒定確認(rèn)為青錢(qián)柳（樣品標(biāo)本存放于本公司）。

2 總黃酮測(cè)定

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.2 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加95%乙醇70 mL，超聲使溶解，加乙醇至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無(wú)水蘆丁0.2 g）。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取洗脫液25 mL，置50 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，過(guò)濾，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液 （0.2 mg·mL-1）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的溶液為空白。照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度B為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.0130X-0.01791（r=0.9996）。蘆丁在8.224～49.344 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 上樣液的制備

取青錢(qián)柳約120 g，粉碎，分別用15、10、10倍量的水提取3次，每次1.5 h，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至適當(dāng)濃度，加乙醇使含醇量為50%，靜置12 h以上，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，備用。

2.4 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

以95%乙醇浸泡過(guò)夜，用純化水洗至無(wú)醇味，再用4%的HCl溶液沖洗，水洗至中性；再用4%的NaOH溶液沖洗，水洗至中性。

2.5 大孔樹(shù)脂篩選

將已處理好的6種大孔樹(shù)脂各15 g濕法裝柱，加入上樣液（相當(dāng)于10 g藥材量），用水洗至流出液近無(wú)色，再用固定量的60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的含量。

表1結(jié)果表明，D101大孔樹(shù)脂對(duì)于青錢(qián)柳總黃酮的吸附純化效果較好，因此選用D101大孔樹(shù)脂分離純化青錢(qián)柳總黃酮。

表1 6種樹(shù)脂篩選比較吸附效果

2.6 大孔樹(shù)脂的飽和吸附

取處理好的樹(shù)脂200mL備用，取青錢(qián)柳上樣藥液以10、20、30、40、50、60、70、80 g（按藥材量計(jì)）上樣，每次上完樣后用水續(xù)洗至無(wú)色，再用60%乙醇400 mL洗脫，測(cè)定乙醇洗脫液的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果表明，上樣量大于60 g時(shí)，乙醇洗脫液的吸光度基本不再變化，故以60 g作為飽和吸附量。

2.7 乙醇洗脫正交試驗(yàn)及結(jié)果

青錢(qián)柳提取液用D101大孔樹(shù)脂吸附后，用純化水沖洗至流出液近無(wú)色，再用適當(dāng)濃度的乙醇洗脫，搜集洗脫液，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，以上樣量A（1.5、2.0、2.5）、上樣流速B（10、20、30 BV·min-1，BV為倍樹(shù)脂體積，下同）、醇洗濃度C（50%、60%、70%）三個(gè)因素作為考察因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。

從試驗(yàn)結(jié)果可知，以總提取物為指標(biāo)，最佳的提取工藝為A1B3C3，即用1.5 BV的上樣量，30 BV· min-1的上樣流速，70%乙醇洗脫效果最佳；而以總黃酮為指標(biāo)，最佳的提取工藝為A1B3C1，即用1.5 BV的上樣量，30 BV·min-1的上樣流速，50%乙醇洗脫效果最佳。由于青錢(qián)柳中黃酮為有效活性成分，所以選用總黃酮作為主要考察指標(biāo)，分析結(jié)果表明，A（上樣量）對(duì)結(jié)果影響較大，B（上樣流速）和C（醇洗濃度）相對(duì)較小，且綜合上樣的效率來(lái)看理想的組合為A1B3C1，確定1.5BV的上樣量，30 BV·min-1的上樣流速，50%乙醇洗脫作為最佳工藝。

2.8 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

按正交試驗(yàn)選取的最佳分離純化工藝條件A1B3C1進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，3次青錢(qián)柳總黃酮的平均含量為75.1%（見(jiàn)表2），表明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 驗(yàn)證A1B3C1工藝

3 討 論

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過(guò)物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，其孔徑與比表面積都比較大，在樹(shù)脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于中草藥中各種成分的分離純化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)D101型大孔樹(shù)脂對(duì)青錢(qián)柳黃酮有較大的吸附量，且容易吸附和解吸，用于分離純化青錢(qián)柳總黃酮效果較好。與傳統(tǒng)的分離方法相比較，應(yīng)用大孔樹(shù)脂分離純化青錢(qián)柳總黃酮，方法簡(jiǎn)便、迅速、經(jīng)濟(jì)。

[1] 謝明勇，李 磊.青錢(qián)柳化學(xué)成分和生物活性研究概況[J].中草藥，2001，32（4）：365-6.

[2] 李 俊，陸園園，許子競(jìng)，等.青錢(qián)柳中黃酮成分的研究[J].中藥材，2005，28（12）:1058-9.

[3] 張曉瑢，廖 循，丁立生.青錢(qián)柳的化學(xué)成分[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2001，7（1）：90-1.

[4] 楊武英，上官新晨，徐明生，等.青錢(qián)柳黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶活性及小鼠血糖的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，29（5）：507-9.

[5] 張全香，苑曉威，趙興華.大孔吸附樹(shù)脂純化骨碎補(bǔ)總黃酮的研究[J].中草藥，2011，42（4）：708-9.