反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定鹽酸林可霉素注射液中乙二胺四乙酸二鈉的含量

屈 蓉，錢桂英，陳 佳

江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，泰州 225300

日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，部分生產(chǎn)廠家的鹽酸林可霉素注射液標(biāo)示輔料有乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA-2Na），這是一種常用的穩(wěn)定劑，在制備注射劑時(shí)加入EDTA-2Na，它與微量的金屬離子形成螯合物后，阻止了金屬離子對(duì)藥物自身氧化的催化作用，有利于提高藥物在制備、存儲(chǔ)和臨床配制過程中的穩(wěn)定性。EDTA-2Na被列為GRAS安全物質(zhì),收載于美國FDA《非活性組分指南》,英國也許可用于非注射和注射給藥制劑。在藥物劑型中EDTA-2Na被用作螯合劑的一般濃度為0.005%～0.1%（W/V）[1]。由于EDTA-2Na可與鈣離子結(jié)合成可溶的絡(luò)合物引起鈣的減少，靜脈注射制劑中使用EDTA-2Na會(huì)導(dǎo)致血鈣下降，因此，須密切關(guān)注和嚴(yán)格控制靜脈給藥制劑中EDTA-2Na的用量。參照相關(guān)文獻(xiàn)，本文建立了鹽酸林可霉素注射液中EDTA-2Na的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2996高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站 （美國Waters公司）；梅特勒AG135電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PHS-25型酸度計(jì) （北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）。

鹽酸林可霉素注射液 （規(guī)格為2 mL：0.6 g，批號(hào)：0912232、1009242、1001245，山東方明藥業(yè)股份有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，上海中試化工總公司，批號(hào)：20080925，純度：97.0%,分析純）；甲醇為色譜純；氯化鐵、四丁基氫氧化銨、甲酸均為分析純;水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：含12.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇和0.052%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的水溶液（用四丁基氫氧化銨調(diào)節(jié)pH值至3.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃。理論板數(shù)按EDTA-2Na計(jì)算為4530。

分別吸取供試品溶液、對(duì)照試劑溶液、陰性樣品溶液各50μL，注入液相色譜儀，記錄HPLC色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜圖在與對(duì)照試劑色譜圖保留時(shí)間相應(yīng)位置上出現(xiàn)色譜峰，陰性樣品無干擾，見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取供試品5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加10 mg·mL-1的三氯化鐵溶液0.1 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照試劑貯備液 取 EDTA-2Na對(duì)照試劑51.91 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加入10 mg·mL-1的三氯化鐵溶液0.5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，備用。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝制備不含EDTA-2Na的樣品，按供試品溶液制備方法制備，作為陰性樣品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

分別量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照試劑貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成2.014、4.028、6.042、8.056、10.070、12.084 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述各溶液50 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，以EDTA-2Na對(duì)照試劑濃度為橫坐標(biāo) （μg· mL-1），進(jìn)行線性回歸。線性方程為Y=67948X-14085，r=0.9998。結(jié)果表明，EDTA-2Na在2.014～12.084 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取6.042 μg·mL-1的EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.5%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、10 h測(cè)定，結(jié)果峰面積RSD為0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)1009242的樣品共6份，按供試品溶液制備方法制備，重復(fù)測(cè)定，測(cè)得EDTA-2Na平均含量為23.27 μg/支，RSD為1.2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取批號(hào)1009242的樣品2.5 mL，共6份，置10 mL棕色量瓶中，分別精密加入含EDTA-2Na的12.084 μg·mL-1溶液2.5 mL后，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定峰面積，測(cè)得平均回收率為98.6%，RSD為1.1%。

2.8 檢測(cè)限和定量限

將對(duì)照試劑貯備液逐級(jí)稀釋后，按10∶1計(jì)算定量限，結(jié)果為10.1 ng，按3∶1計(jì)算檢出限，結(jié)果為2.5 ng。

2.9 樣品含量測(cè)定

按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備3個(gè)不同批號(hào)鹽酸林可霉素注射液 （批號(hào)分別為：0912232、1009242、1001245），EDTA-2Na含量分別為26.32 μg/支、23.27 μg/支、24.11 μg/支 （折算成濃度分別為0.001%、0.001%、0.001%）。

3 討 論

3.1 由于EDTA-2Na易與金屬離子螯合，在色譜柱中，EDTA-2Na和色譜柱不銹鋼表面會(huì)發(fā)生絡(luò)合，使EDTA-2Na的響應(yīng)值低，峰形嚴(yán)重脫尾。為避免EDTA-2Na和色譜柱不銹鋼表面發(fā)生作用，提高檢測(cè)靈敏度，改善峰形，根據(jù)其可與一些金屬離子生成具有紫外吸收的穩(wěn)定絡(luò)合物的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，EDTA-2Na與Cu2+可形成穩(wěn)定的螯合物，穩(wěn)定常數(shù)= 1018，而與Fe3+可形成更為穩(wěn)定的螯合物且有紫外吸收（紫外吸收光譜圖見圖2），穩(wěn)定常數(shù)=1025.1[2]，故本方法選用EDTA-2Na與FeCl3反應(yīng)形成穩(wěn)定的螯合物，在254 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。

圖2 EDTA-2Na-Fe絡(luò)合物的紫外吸收光譜圖

3.2 四丁基氫氧化銨是離子對(duì)試劑，四丁銨基與EDTA-2Na螯合鐵離子結(jié)合成中性離子對(duì)，保留于C18固定相[3]。在反相離子對(duì)色譜中，流動(dòng)相的pH值、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑的種類、比例及離子對(duì)試劑的種類和濃度都將影響分離的選擇性。曾試驗(yàn)采用了0.006 mol·L-1四丁基氫氧化銨溶液 （pH為6.5± 0.1）-乙睛 （75∶25）（取四丁基氫氧化銨6.0 mL于195 mL水中，用1 mol·L-1磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.5± 0.1，加乙睛250 mL，加水至1000 mL，搖勻，即得），在此色譜系統(tǒng)中，對(duì)照品能較好的出峰，但樣品在與對(duì)照品保留時(shí)間相應(yīng)位置處出現(xiàn)信號(hào)較強(qiáng)的倒峰；又試驗(yàn)了含12.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇和0.052%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的水溶液 （用四丁基溴化銨調(diào)節(jié)pH值至3.5），發(fā)現(xiàn)此色譜系統(tǒng)中EDTA-Fe絡(luò)合物出峰太快，與雜質(zhì)峰未能達(dá)到基線分離。采用本文所用的流動(dòng)相，EDTA-Fe絡(luò)合物峰形較好，且能與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，故采用此色譜條件。

3.3 樣品中所加EDTA-2Na的量并未達(dá)到0.005%～0.1%的濃度范圍，說明此工藝有待進(jìn)一步考證。

[1] 刁巖忠，韓繼永，陳祥峰.HPLC法測(cè)定注射用泮托拉唑鈉中乙二胺四乙酸二鈉的含量 [J].藥物分析雜志，2011，31（2）：282.

[2] 黃 建，李文仙，霍軍生.反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定果味飲料中的乙二胺四乙酸二鈉 [J].中國食品工業(yè)，2009（6）：56.

[3] 耿志旺，劉 蔚，劉 茜，等.HPLC法測(cè)定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量[J].藥物分析雜志，2011，31（3）：588.