HPLC法測定藥物主成分及雜質(zhì)方法驗證探討

夏振華，井鳳鳴，周 艷

蘇州第四制藥廠有限公司，蘇州 215008

HPLC法在藥品生產(chǎn)企業(yè)使用廣泛，其分析方法驗證體現(xiàn)了企業(yè)的技術(shù)水平，同時在新藥國內(nèi)外申報和GMP檢查中也非常關(guān)鍵[1-3]，如我國新版GMP[4]不少章節(jié)反復(fù)強調(diào)分析方法應(yīng)當經(jīng)過驗證或確認。歐洲GMP[5]也要求分析方法要進行驗證，所有上市產(chǎn)品按照批準方法進行控制。美國FDA早就提出相應(yīng)的要求，如2010年10月到2011年9月有14家制藥公司由于分析方法驗證問題收到了其警告信（其中中國有4家）[6]。本文根據(jù)現(xiàn)有的一些分析方法的驗證指南，并結(jié)合實際就HPLC法的驗證操作過程提出一些見解。

1 分析方法驗證（Validation）、確認（Verification）和轉(zhuǎn)移（Transfer）的定義

分析方法的驗證主要是對新建立的分析方法（如HPLC）進行一系列的測定，以考察測定的結(jié)果始終符合預(yù)期目的過程。

而確認系指已有的藥典方法、藥政部門批準的和一些文獻發(fā)表的經(jīng)過驗證的方法，主要是考察由于不同的分析實驗室的實際操作條件、不同制劑配方和不同原料藥工藝下能否適用，同時驗證的方法也未必是最好的方法，包括藥典方法。

方法轉(zhuǎn)移適用于企業(yè)之間或大公司的不同實驗室之間，主要確認接受方和轉(zhuǎn)移方測試的等效性，待轉(zhuǎn)移的方法事先已經(jīng)過驗證并通過。轉(zhuǎn)移的方式多種，轉(zhuǎn)移的方式包括無轉(zhuǎn)移行動、方法審核和比較性測試3種，見表1。

表1 分析方法驗證、確認和轉(zhuǎn)移比較

2 方法驗證（Validation）

驗證所需測定的項目為：專屬性：精密度（包括重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性）；準確度；檢測限和定量限；線性和范圍；耐用性等項目，每個項目測定都有其目的以及接受的標準。

2.1 專屬性

專屬性主要看主成分、雜質(zhì)、賦形劑等相互干擾情況。對HPLC法，可用保留時間（RT）或相對保留時間（RRT）、分離度來表示，對于主成分含量測定，主要考察主成分和其它雜質(zhì)的分離情況，對于雜質(zhì)測定除考察和主成分分離情況，還要考察雜質(zhì)之間的分離情況（包括雜質(zhì)是否能洗脫等）。

對于用于穩(wěn)定性測試的方法驗證，需要增加進行強降解實驗來考察方法的專屬性，通過苛刻的條件在較短的時間內(nèi)加速降解，主要考察降解產(chǎn)物是否和主成分重疊，從而影響穩(wěn)定性的考察，其次可以了解產(chǎn)品的降解途徑和雜質(zhì)產(chǎn)生情況，這和影響因素試驗?zāi)康牟煌械膹娊到庠囼灦家獪y定峰純度。

對于固體制劑一般只做固態(tài)下的強降解試驗（如光照、高溫、高濕），而對于液體制劑和原料藥，液固狀態(tài)下的試驗一般都要進行（如酸、堿、氧化、光照、高溫、高濕）。主成分一般降解到約75%，如果產(chǎn)品穩(wěn)定，降解時，可最長放置10天，如果不穩(wěn)定，可以少放置一些時間，可以預(yù)先試驗，如果產(chǎn)品不溶于酸或堿性水溶液，可以先使用有機溶劑溶解，然后加入一定量的酸和堿溶液。

特別注意的是強降解試驗?zāi)康闹饕强疾熘鞒煞址搴碗s質(zhì)純度以及主成分和雜質(zhì)降解途徑，所以它不是一個定量測定項目，沒有必要也無法取得各組分的物料平衡，其原因為各種條件降解的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，很難取得每個降解雜質(zhì)的對照品，測定的只能是和主成分相比的表觀含量，很難得到樣品中各降解雜質(zhì)的真實含量，如需要了解所有雜質(zhì)是否洗脫并檢測，可以開發(fā)梯度和液質(zhì)連用技術(shù)來考察，而不是使用物料平衡方法來解決這一問題。

2.2 精密度

精密度包括重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。重復(fù)性和中間精密度是實驗室內(nèi)部精密度，而重現(xiàn)性用于實驗室之間的精密度。

重復(fù)性的測定方法ICH推薦2種方法，在規(guī)定定量范圍內(nèi)，至少3個濃度和至少9次（獨立樣品或?qū)φ掌罚y試（3濃度80%、100%和120%，各3次），或者100%濃度至少6次（獨立樣品或?qū)φ掌罚?/p>

中間精密度的測定也可與耐用性項目一起測試，主要是確定不同條件下測定的波動情況。通常情況下，選擇2位分析師2個場合（一般2臺儀器）分別分析獨立制備的6個樣品（12個結(jié)果進行評估）即可。

重現(xiàn)性的測試需要不同的實驗室，企業(yè)難于做到，一般法規(guī)不作要求，根據(jù)實際條件中間精密度和重現(xiàn)性只選擇測定其中一個，不必重復(fù)進行。

精密度的接受標準往往采用相對標準偏差（RSD）來考察，具體接受標準依據(jù)待分析樣品的分析方法、質(zhì)量標準分別規(guī)定。

2.3 準確度

準確度常常使用回收率來表示，對于主成分測定方法，由于測定是采用主成分的對照品來進行的，由于其結(jié)構(gòu)一樣，通常只做常規(guī)測試濃度下的80%、100%和120%的3個濃度，每個濃度進行3個獨立樣品測試，結(jié)果為9個數(shù)據(jù)進行回收率、相對標準偏差計算。對于雜質(zhì)的測定方法則相對復(fù)雜，由于常規(guī)測試方法往往是雜質(zhì)相對于主成分的含量（即表觀含量），但雜質(zhì)和主成分結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致響應(yīng)不同（如紫外檢測器的吸收系數(shù)不同），因此，較科學(xué)的做法是得到雜質(zhì)對照品，在測定準確度的同時測定其響應(yīng)因子，否則，回收率是無法符合接近于100%的要求。此外由于雜質(zhì)的含量范圍比較寬，一般低濃度取定量限 （或報告限，一般為0.05%），高濃度取質(zhì)量標準規(guī)定值的1.5倍，在此濃度范圍內(nèi)進行5或6個獨立樣品的測定（由于雜質(zhì)對照品很難獲得，也可以使用貯備液進行稀釋作為獨立樣品），當無法得到雜質(zhì)對照品時，準確度的測定只能測定表觀的準確度而非真實準確度，藥政部門一般根據(jù)實際情況也予以接受。

準確度的接受標準往往采用回收率和RSD%來計算，具體接受標準依據(jù)不同質(zhì)量要求，各公司的規(guī)定不盡相同，沒有統(tǒng)一標準。

2.4 檢測限和定量限

檢測限和定量限的測定方法基本一致，只是計算的指標不同。有2種方法測定：一種為信噪比為3/1（對于檢測限）和10/1（對于定量限）時的相對濃度或絕對量，這是優(yōu)選的方法；另外一種是，根據(jù)響應(yīng)值的標準差（空白的標準差）和斜率（線性范圍曲線斜率）來計算：DL=3.3δ/S（檢測限）和DL=10δ/S（定量限）。

檢測限和定量限的接受標準通常有2個，其中最常用和最方便的方法為：對于檢測限3個獨立樣品得3個數(shù)據(jù)都大于3倍噪音。對于定量限6個獨立樣品得6個數(shù)據(jù)都大于10倍噪音。檢測限和定量限最后一定要通過一系列接近估計值的樣品實際測定來驗證，如和估計值不一致，采用測量值而不是估計值。

2.5 線性和范圍

關(guān)于線性和范圍的濃度范圍，主成分測定方法和雜質(zhì)測定方法不同，對于主成分測定，是常規(guī)測試濃度下的80%至120%（溶出度是規(guī)定范圍的±20%，或50%至150%，含量均勻度是測定濃度的70%至130%）的范圍內(nèi)，5到6個樣品濃度進行測定。而對于雜質(zhì)測定，是定量限（或報告限，一般為0.05%）至標準規(guī)定值的1.5倍濃度范圍內(nèi)，5或6個樣品濃度進行測定，為減少工作量，可以和準確度項目一起進行。

線性和范圍得出的回歸方程除考察相關(guān)系數(shù)至少大于0.99（但HPLC方法至少大于0.999）外，特別注意還需要考察其截距。國家食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定回歸曲線Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)[7]，其實這個要求很低。建議使用和測定中間濃度對照法，即測定的其他濃度點的響應(yīng)和中間濃度（往往是實際測定濃度）點的響應(yīng)進行計算，其所有值的相對標準差應(yīng)不大于10%。只有在證明呈線性后，才能使用一個濃度的對照溶液進行日常的測定，如不符合規(guī)定，應(yīng)對分析操作（如流動相的背景吸收，溶劑的選擇等方面）進行調(diào)查或采用多點標準校正。

2.6 耐用性

任何系統(tǒng)（如儀器波長、流量、柱溫、緩沖液的pH等）都存在誤差，而所有測試又都要符合系統(tǒng)適用性參數(shù)要求（如柱效、分離度、拖尾因子、保留時間等），作為方法驗證必須考慮到這些偏差因素。耐用性是指方法在參數(shù)有小的變化時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。USP[8]對可以變化的參數(shù)范圍作了具體規(guī)定,其可以變化的前提是基于耐用性試驗結(jié)果，如按照其所規(guī)定的范圍變化視為相同方法而不需要再驗證。

耐用性一般包括：儀器方面如流量、檢測波長、柱溫、色譜柱；操作方面如緩沖液的pH、流動相的比例；樣品方面如溶液穩(wěn)定性；其考察指標為目標峰的系統(tǒng)適用性參數(shù)是否符合規(guī)定。但樣品溶液穩(wěn)定性是考察其含量不降低（一般規(guī)定降低不超過1%）。

3 方法確認（Verification）

方法確認的操作和驗證相同，但進行的項目就要少得多，測定哪些項目與測定的方法本身有關(guān)，同時還與測定的目的有關(guān)，各個公司一般都制定具體的要求，需要說明的是：不是USP、EP所有項目都要確認，如pH、水分、重金屬、灰分、比旋度、熔點等簡單操作，不必進行確認，有些只要進行檢測前儀器校正等工作。如果藥典方法確認失敗，先查找原因，如確是方法本身缺陷，可與藥典部門聯(lián)系，提出建議，比如修改或替代。

4 方法轉(zhuǎn)移（Transfer）

方法轉(zhuǎn)移往往伴隨著企業(yè)的其他技術(shù)或產(chǎn)品轉(zhuǎn)移的，WHO[8]有專門技術(shù)轉(zhuǎn)移指南，USP[9]也專門對分析方法的轉(zhuǎn)移提出要求。

5 討 論

5.1 雜質(zhì)分析和主成分分析驗證的比較

雜質(zhì)分析和主成分分析驗證的項目、要求有很多差別，見表2。

表2 雜質(zhì)分析和主成分分析驗證比較

5.2 關(guān)于是否加入樣品或空白處方問題

5.2.1 對于雜質(zhì)測定方法驗證 專屬性、精密度、準確度（響應(yīng)因子）、耐用性都應(yīng)該加樣品，以考察樣品的存在對雜質(zhì)測定的影響，而線性、檢測限、定量限測定如果制備不到不含雜質(zhì)的樣品，建議不加樣品進行測定，加樣品反而導(dǎo)致更大的誤差。

由于樣品一般都含有雜質(zhì)，所以在測試相關(guān)項目需加樣品時，其樣品雜質(zhì)越低越好（最好沒有），如含有，注意考慮樣品本身雜質(zhì)和加入的雜質(zhì)濃度總和來進行驗證方案的濃度設(shè)計，并在計算過程中扣去樣品本底。

5.2.2 對于制劑主成分的測方法定驗證 專屬性、精密度、準確度、線性、耐用性都應(yīng)該模擬配方。

5.2.3 對于原料藥主成分測定方法驗證 只有準確度項目需要加樣。

5.3 雜質(zhì)響應(yīng)因子問題

雜質(zhì)如按照常規(guī)檢測相對于主成分的含量，其響應(yīng)因子非常重要，一般測定的響應(yīng)因子如在0.8～1.2之間[10]可以作為1，而響應(yīng)因子小于0.2，大于5，則說明檢測方法不適用，建議改用其他方法。

5.4 其他問題

分析方法和儀器的確認（Qualification）不同，不需要進行再驗證，除非測定樣品的工藝和配方產(chǎn)生變化，或方法本身發(fā)生改變才有必要進行再驗證。此外，分析方法驗證必須在儀器周期性確認（Qualification）有效期內(nèi)進行。每個驗證項目都必須在系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)測定符合規(guī)定后方可進行，如有必要應(yīng)再校正。

[1] The Interna tionalConference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).Q2(R1)Validation of Analytical Procedure:Text and Methodology[S].

[2] U.S.Pharmacopoeia 34.Validation of Compendial Procedures[S].2010:621,1225.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].附錄 XIX A藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則，2010.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[S].2010.

[5] European Commission.Good Manufacturing Practice Medicinal products for Human and Veterinary Use.Part II:Basic Requirements for Active Substances used as Starting Materials:12 Validation[S].2008.

[6] BeckerG.Inadequate validation ofanalyticalmethods remains permanene topic in warning letters to APImanufactures[EB/OL].http://www.gmp-compliance. org/eca_news_2930_7215,7186,7305,7182,7153_rss.html.

[7] 黃曉龍.有關(guān)物質(zhì)分析方法驗證的可接受標準簡介[J].化學(xué)藥物評價，2006-02-08.

[8] World Health Organization(WHO).Annex 7.WHO guidelines on transfer of technology in pharmaceutical manufacturing[S].

[9] U.S.Pharmacopoeia 35.Transfer of Analytical Procedures[M].1224.

[10] 謝沐風(fēng).如何建立高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)的方法[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（1），45-8.