載藥動脈栓塞微球DC BeadTM研究進展

金雪鋒，許 穎，沈曉蘭，陳祥峰，宗在偉

1江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，南京 211112；2江蘇大學藥學院藥物制劑教研室，鎮(zhèn)江 212013

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，是世界第三大癌癥死因。2008年，全球約696000名患者死于該癥[1]。在我國，HCC發(fā)病率及死亡率均居世界前列。目前，手術切除仍是早期HCC首選的治療手段[2]。但是，HCC早期癥狀常常不明顯，隱匿性較高，絕大多數(shù)患者就診時已臨癌癥中晚期，失去了手術治療的最佳時期；此外，受肝功能狀況、病變部位及病人全身疾病等因素影響，病人可能無法耐受切除手術。因此，非手術方法，如介入治療（Interventional treatment），就成為治療HCC的重要手段[3]。經(jīng)導管肝動脈化療栓塞術（Transarterial chemoembolization，TACE）是公認的介入治療中晚期HCC的有效方法[4]。TACE結合了肝動脈栓塞（Transarterial embolization，TAE）和局部化療兩種治療技術優(yōu)勢，理想的TACE應使腫瘤部位維持長時間的高藥物濃度，同時使體循環(huán)中藥物濃度降至最低[5]。但傳統(tǒng)的TACE常用碘化油與化療藥物混合給藥，所用的化療藥物往往為水溶性，其在碘化油中相容性差，經(jīng)肝動脈給藥后，大部分藥物從碘化油中迅速釋放并進入體循環(huán)[6]，存在較高的全身不良反應風險；另外，大量的碘化油可導致肝臟薄壁組織或者膽管的損傷[7-8]。載藥洗脫微球（Drug-eluting beads，DEB）作為TACE治療的一種新的藥物遞送系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)制劑的不足，其可在腫瘤部位持續(xù)而緩慢的釋放藥物，使藥物在病灶部位長時間維持有效的細胞毒濃度，同時可降低全身血藥濃度水平。DEB長期以來一直受到國內(nèi)外研究者的普遍關注，但目前成功上市的載藥栓塞微球僅有DC Bead和Hepasphere，兩者均可負載阿霉素（Doxorbicin）用于肝癌的治療（分別為Biocompatibles公司和BioSphere公司產(chǎn)品）。DC Bead-阿霉素是最早獲得上市的產(chǎn)品。本文就DC Bead近年來研究內(nèi)容予以綜述，為同類產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒。

1 DC Bead制備方法

DC Bead采用反相懸浮自由基聚合法（Inverse suspension free-radical polymerisation）制備[9]。主要過程（圖 1）如下：聚乙烯醇[Poly（vinyl alcohol），PVA]經(jīng)N-丙烯酰-氨基乙醛-二甲基縮醛（N-acryloyl-aminoacetaldehyde dimethylacetal，NAAADA）修飾后的大分子單體與另一單體2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸鈉 （2-acrylamido-2-methylpropanesulphonate sodium salt，AMPS）的混合水溶液混懸于醋酸丁酯，該W/O體系以醋酸丁酸纖維素（Cellulose acetate butyrate）維持穩(wěn)定，防止絮凝及沉積。過硫酸鉀與四甲基乙烯二胺（Tetramethylethylenediamine，TMEDA）組成氧化-還原引發(fā)體系，前者溶于水相，后者在混懸液加熱至60℃后加入油相。TMEDA一旦加入，聚合過程即被引發(fā)，各單體交聯(lián)，形成水溶脹型網(wǎng)絡結構球體，即DC Bead。制得DC Bead的粒徑及分布與穩(wěn)定劑用量、PVA分子量及濃度有關。穩(wěn)定劑用量越高，微球粒徑越小，分布也較集中；而PVA分子量或濃度越大，微球粒徑越大，分布也越寬。控制不同的聚合條件，即可制得不同粒徑的DC Bead。Biocompatibles公司的產(chǎn)品有多種不同粒徑，分別為700～900 μm（綠色）、500～700 μm（紅色）、300～500 μm（藍色）、100～300 μm（黃色）以及更小的尺寸70～150 μm。

圖1 DC Bead合成示意圖

2 載藥機理與性質(zhì)特征

DC Bead一般在臨用前與藥物混合實現(xiàn)載藥。DC Bead網(wǎng)絡結構中的陰離子型磺酸基團可與荷正電藥物通過庫侖力相互吸引而結合?？韶撦d的藥物有阿霉素[10]、伊立替康（Irinotecan）[11]、拓撲替康（Topotecan）[12]、表柔比星（Epirubicin）[13]等。這些藥物的共同特點是分子結構中含親核基團，可結合H+而荷正電。市售水溶脹后的DC Bead 1 mL最大約可負載40 mg鹽酸阿霉素，但超過37.5 mg·mL-1的負載量時，達到99%的包封率所需時間將急劇增加（圖2）[10]。臨床使用時，DC Bead對鹽酸阿霉素的負載量不超過37.5 mg·mL-1，否則，可能因為藥物負載不完全導致游離藥物濃度過高而增加全身不良反應的風險[14]。不難理解，DC Bead對藥物的負載量與交聯(lián)分子鏈中磺酸基團的數(shù)量有關，同樣體積的DC Bead，結構中磺酸基團數(shù)目越多，對藥物的負載量越高。有研究[10]顯示，不同粒徑的DC Bead對藥物的最大負載量無顯著性差異?？梢?，DC Bead粒徑雖有不同，但單位體積的磺酸基團含量基本相同。忽略合成過程中AMPS的損失，1 mL DC Bead約含磺酸基團7.7×10-5mol[15]。

圖2 單位體積的Bead中投入阿霉素的質(zhì)量（阿霉素目標負載量）對實際負載量的影響（□）；實現(xiàn)≥99%包封率所需時間（●）（mean,n=6）

DC Bead對藥物的最大負載量雖不受粒徑大小影響，但負載速度卻與粒徑有關。相同體積的DC Bead，粒徑越小，表面積越大，單位時間內(nèi)吸附結合藥物的幾率也越大，達到相同的負載量，所需時間就越短。不同粒徑DC Bead每1 mL負載25 mg鹽酸阿霉素所需時間見表1[16]，所有Bead在2小時內(nèi)均可完成99%的包封率。

表1 不同粒徑DC Bead負載阿霉素速率比較

市售DC Bead保存于磷酸鈉緩沖溶液中，使用時用注射器抽取并濾除磷酸鹽溶液，隨后將其與藥物溶液混合。否則，磷酸鹽解離后的正負離子將影響磺酸基團與藥物的結合，降低藥物包封率[10]。

載藥后的DC Bead粒徑將減?。回撦d量越大，粒徑減小越顯著。如規(guī)格為700～900 μm的Bead對鹽酸伊立替康的負載量為20 mg·mL-1時，粒徑減小約8%；當負載量增大為50 mg·mL-1，粒徑減小約29%[15]。除100～300 μm的Bead外，其他規(guī)格Bead在相同的載藥量時粒徑減小程度接近[10、15]。有學者認為[10]DC Bead載藥過程中將釋放出原先結合的鈉離子，并且原先在離子基團周圍結合的水分也將被置換，同時藥物的疏水性強弱，決定置換出水分的多少。當鹽酸阿霉素的負載量為40 mg·mL-1時，DC Bead將失去10%的水分。由于水分喪失，球體收縮，從而粒徑減小。除此之外，筆者認為，DC Bead與藥物結合后其內(nèi)部離子型磺酸基團數(shù)目減少，同電荷斥力減弱，聚合物鏈伸展程度降低，也會導致球體收縮、粒徑減小[17-18]。需要注意的是DC Bead體積減小，致使其彈性模量增大，可壓縮性減弱，易在管腔內(nèi)聚集堵塞，不利于微導管輸送。

掃描電子顯微鏡顯示DC Bead表面光滑，內(nèi)核呈海綿狀，外層20 μm厚度范圍結構致密。熒光顯微鏡顯示DC Bead表面藥物分布均勻。激光共聚焦顯微鏡及拉曼熒光顯微鏡均顯示藥物主要分布在DC Bead外層20 μm厚度的結構中[10]。

3 In vitro釋放研究方法

DEB的in vitro釋放研究方法有兩種：USPⅡ法（槳法）及T-apparatus法[19]。對于鹽酸阿霉素，前者采用20%（w/v）的氯化鉀溶液與乙醇的混合溶液（體積比30∶70）為釋放介質(zhì)，所有粒徑的DEB在4小時內(nèi)即釋藥完全。該法于加速條件下評價DEB釋藥特征，未準確模擬DEB體內(nèi)釋放環(huán)境，但可便利地為產(chǎn)品開發(fā)及質(zhì)量保證提供數(shù)據(jù)，計算藥物在Bead中的擴散系數(shù)。T-apparatus法原理如圖3所示[16]，該法良好地模擬了栓塞操作后的體內(nèi)情形，即藥物在靜態(tài)環(huán)境下擴散釋放。T-apparatus法與DEB in vivo釋放行為具有良好的線性相關性[15、19]，可較準確地預測DEB in vivo釋放結果。

圖3 進行載藥Bead釋放度試驗的T-apparatus示意圖

DEB通過離子交換機制釋放藥物[20]。載阿霉素DEB在純水中基本不釋放藥物，但隨著溶液中離子強度增加（如氯化鈉濃度增加），釋藥速率也逐漸增大。1 mL載25 mg鹽酸阿霉素DEB浸潤在250 mL 0.45%的氯化鈉溶液中，1、5小時分別釋放阿霉素約0.22 mg、0.92 mg；而在0.9%的氯化鈉溶液中，相同時間分別釋放藥物約0.45 mg、1.56 mg。USPⅡ法in vitro釋放研究結果顯示，藥物的洗脫常數(shù)與Bead粒徑相關，同樣體積的Bead，粒徑越小，表面積越大，釋藥速率常數(shù)越大，藥物釋放也越快；然而，T-apparatus法研究結果并未顯示該規(guī)律，其原因在于：USPⅡ法接近漏槽條件，Bead與溶出介質(zhì)的接觸面積成為影響藥物釋放的重要因素；T-apparatus法使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，體積僅為USPⅡ法的1/4.5，并且Bead周圍介質(zhì)流速較慢，因此藥物的溶解度及介質(zhì)中藥物濃度成為影響釋放的主要因素[19]。采用T-apparatus法，不同粒徑、不同載藥量DEB釋藥速率常數(shù)及釋藥半衰期如表2所示[19]。可見，同樣粒徑Bead，藥物負載量越高，釋藥速率常數(shù)越大，但釋藥半衰期也大；同樣的負載量，100～300 μm的Bead釋藥半衰期最短，但粒徑與釋藥速率常數(shù)及半衰期均無規(guī)律性變化關系。

表2 不同負載量或不同粒徑載阿霉素DC Bead緩釋常數(shù)及釋藥半衰期比較

4 藥動學及組織分布

DEB化療栓塞與傳統(tǒng)化療栓塞法（將阿霉素乳化于碘化油后肝動脈注射，再采用明膠海綿進行栓塞）藥動學特征有顯著性差異。肝癌患者人體試驗顯示，DEB化療栓塞與傳統(tǒng)化療栓塞平均給藥劑量分別為（106.4±37.2）mg與（70.0±11.2）mg時，給藥5 min之內(nèi)，兩種治療方法外周血藥濃度均達到峰值，但是后者峰濃度為（895.66±653.1）ng·mL-1，前者僅（78.97±38.3）ng·mL-1；給藥后7天，傳統(tǒng)栓塞AUC （1532.98±295.2）ng·min·mL-1，而 DEB僅（662.6±417.6）ng·min·mL-1。可見，無論外周血峰濃度還是AUC，DEB法均顯著低于傳統(tǒng)栓塞[6]。由于DEB化療栓塞法降低了外周血藥濃度，從而減少了藥物全身不良反應。

DEB在體內(nèi)具有緩釋效應。健康的Yucatan小型豬經(jīng)阿霉素DEB栓塞后1個月，Bead釋放起始負載藥量的43%，3個月釋放起始藥量的89%[21]。在這兩個時間點，100～300 μm和700～900 μm不同粒徑的Bead釋藥行為無顯著差異，該結論與T-apparatus法體外釋放研究結果一致。阿霉素經(jīng)洗脫后，在離Bead邊緣600 μm的范圍內(nèi)進行了濃度檢測，距Bead表面越遠，組織藥物濃度越低。同樣的藥物負載濃度（37.5 mg·mL-1），不同粒徑的Bead周邊組織藥物濃度也有差異，粒徑較小的Bead，由于單一個體藥物負載量較小，周邊組織藥物濃度相應較低。100～300 μm Bead在1、3個月時平均組織藥物濃度分別為1.05 μmol·L-1、0.75 μmol·L-1；其顯著低于700～900 μm Bead在這兩個時間點平均組織濃度（分別為2.05 μmol·L-1、1.25 μmol·L-1）。有資料[22]揭示，肝細胞癌外植體與阿霉素孵育4天，IC50為0.97 μmol·L-1，EC50為3.06 μmol·L-1。以上數(shù)據(jù)顯示不同規(guī)格Bead在1個月時周邊組織平均阿霉素濃度在此范圍。

人肝癌患者進行100～300 μm的阿霉素DEB栓塞后，離體肝臟中Bead周圍組織阿霉素含量檢測結果顯示，藥物浸滲到栓塞血管周圍至少1.2 mm的直徑范圍[23]。栓塞后8小時移植離體的肝臟，組織平均藥物濃度為5 μmol·L-1；栓塞后9～14天移植離體的肝臟，組織平均阿霉素濃度為2.10 μmol·L-1；而栓塞后1月移植離體的肝臟，阿霉素平均濃度下降至0.65 μmol·L-1。該藥物濃度經(jīng)時變化過程足以對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒效應[22]。栓塞后8小時離體肝臟檢測結果顯示，約有42%的栓塞血管存在于瘤內(nèi)，而腫瘤內(nèi)外栓塞血管的藥物濃度無顯著差異。栓塞后9～14天，約37%的栓塞血管出現(xiàn)壞死；32～36天，約40%的血管壞死，可能由于樣本量較少（兩者病例數(shù)依次為3、2名），兩者無顯著差異 （P= 0.103）；然而在32～36天時，壞死組織與非壞死組織相比，藥物滲透更深、局部濃度更大（P=0.003）[23]。

5 臨床研究評價

臨床I/II期的研究證明了阿霉素DEB的安全性及有效性[24]。I期15名患者，每3名為1組，共5組，依次給予阿霉素25 mg、50 mg、75mg、100 mg、150 mg；II期20名患者均給予150 mg。阿霉素劑量高達150 mg，未見劑量限制性毒性。在30天的治療期內(nèi)，治療相關的綜合癥發(fā)生率為11.4%。依據(jù)新的腫瘤治療評價標準，栓塞后1個月，腫瘤部分緩解率63.3%，完全緩解率6.7%。

Song等[25]研究比較了阿霉素DEB-TACE與傳統(tǒng)碘化油TACE對亞洲地區(qū)肝細胞癌患者的療效，結果顯示前者比后者具有明顯優(yōu)勢。治療組（20例）與對照組 （20例）Child-Pugh分級大部分為A級（34例），少數(shù)為B級（6例）。給藥后1個月，依據(jù)新的實體腫瘤的療效評價標準，DEB治療組總緩解率為85%，傳統(tǒng)TACE對照組總緩解率30%（P= 0.001）。大腫瘤 （＞5 cm）或者多節(jié)結型腫瘤采用DEB治療的緩解率也顯著高于傳統(tǒng)TACE（P=0.003與P=0.005）。兩者大腫瘤治療緩解率分別為83%、16%，多節(jié)結型腫瘤緩解率依次為83%、25%。阿霉素劑量為50 mg，DEB與傳統(tǒng)TACE肝臟毒性無顯著差異。

一項在歐洲5個國家共計19個中心開展的前瞻性隨機對照研究（PRECISION V）[26]中，納入了212個肝功能為Child-Pugh A或B級的不可切除的肝癌患者，隨機接受DEB-TACE治療（102例）或傳統(tǒng)的TACE治療（110例）。以6個月腫瘤緩解率為主要評估終點，在總體上DEB-TACE雖優(yōu)于傳統(tǒng)的TACE，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.11）；然而，在重癥患者（Child-Pugh B級、體能評分1分、雙葉病灶或復發(fā)性癌癥）中，DEB-TACE組表現(xiàn)出了更高的完全緩解率 （25.4%比13.9%，P=0.091）、客觀緩解率（52.4%比34.7%，P=0.038）及疾病控制率（63.5%比44.4%，P=0.026）。此外，DEB-TACE顯著降低了嚴重肝毒性（P＜0.001）及阿霉素相關的不良反應發(fā)生率 （P=0.0001）。該項研究結果顯示DEB-TACE治療肝細胞癌安全、有效，對于晚期重癥患者更具優(yōu)勢。

DEB-TACE還使患者在生存期上獲益[27]。71名患者，其中45例接受DEB化療，其余26例接受傳統(tǒng)化療栓塞。兩組中位存活期分別為610天（351～868）及284天（4～563；P=0.03）。Okuda分級I期患者，兩組存活時間分別為501天（421～528）及354天（148～560；P=0.02）。Child-Pugh分級A或B的患者，兩組存活時間分別為641天（471～810）及323天（161～485，P=0.002）。CLIP（Cancer of Liver Italian Program）評分≤3的患者，中位生存期依次為469天（358～581）及373天（195～551，P=0.03）。依據(jù)NCI CTCAE 3.0毒性評級區(qū)分，第5級臨床毒性兩者相似。最近的一份研究[28]顯示，104名患者 （除1名外，其余肝硬化，62.5%丙型肝炎，95% Child-Pugh為A級；癌癥分期BCL-A期41名，B期63名）接受DEB-TACE治療，總體中位存活期為48.6個月，BCLC-A為 54.2個月，BCLC-B為47.7個月。

6 問題與展望

DEB用于不可切除的HCC治療，6個月的完全緩解率及部分緩解率為44%～80.6%[29]，但仍有部分患者未達到預期療效，其原因可能是多方面的。理論上認為，正常肝組織從門靜脈獲取約2/3必須的血流供應，其余來自肝動脈；而原發(fā)和轉移性肝癌的血供幾乎全部來自肝動脈，極少由門靜脈供血[30]，進行肝動脈栓塞，可以阻斷或減少腫瘤的主要供血，使腫瘤發(fā)生壞死、縮小以至消失，而正常肝組織不會受到嚴重影響。但是在腫瘤組織及血液中血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達，其與血管內(nèi)皮細胞的相應受體結合，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，進而促進新生毛細血管及側支循環(huán)的形成，從而有助于腫瘤細胞逃脫TACE的打擊，增加其存活的機會，使栓塞治療失敗[31]。因此，TACE與其他治療手段的結合，對減少腫瘤再生或擴散也許更有利。例如將VEGF抑制劑如索拉非尼與阿霉素DEB結合應用可能是一個具有前景的治療方案，但仍需通過進一步的隨機對照研究證實[32]。

DC Bead雖具有良好的生物相容性[33]，但不具備生物降解特性，其造成動脈閉塞是永久性的。對于Bead是否應該采用降解性材料，目前觀點不一。有觀點認為暫時性栓塞比永久性栓塞更有益[34]，主要體現(xiàn)在較輕的栓塞后綜合癥，以及可進行重復操作。但是大量的臨床實踐證明，選擇合適的粒徑，可對同一患者進行多次DEB栓塞[29]，因此，有學者認為DEB的生物降解性無合理的臨床需求依據(jù)[35]。

在臨床應用時，對DEB粒徑的選擇同樣尚無一致的觀點。雖然粒徑較大的DEB釋藥緩慢，可對腫瘤細胞形成持久的細胞毒效應，而粒徑較小的DEB釋藥較快，突釋也較明顯[15-16]，但是有學者認為小粒徑DEB為優(yōu)選[29]，原因在于小粒徑DEB可滯留于腫瘤內(nèi)血管末梢，實現(xiàn)瘤組織大量藥物的遞送。而一些研究者建議，依據(jù)病灶部位尺寸、供給動脈的直徑以及腫瘤血管分布選擇合適的Bead[36]。

DC Bead通過電荷吸附實現(xiàn)載藥，目前應用僅局限于正電荷藥物，對于非離子型或陰離子型藥物的負載存在困難。近期的一份研究[37]揭示，采用二甲基亞砜實現(xiàn)了非離子型、低水溶性的雷帕霉素（rapamycin）的負載，載藥量約30 mg·mL-1，但是其載藥過程繁瑣，臨床難以推廣。

DEB-TACE栓塞時，通過檢測非離子型造影劑順流性變化監(jiān)控栓塞過程。當順流減少，但又無栓塞劑回流導致肝臟外血管阻塞，即為栓塞過程終點。該過程無法反饋DEB或負載藥物的具體定位信息。為彌補該不足，有研究者[38-40]開發(fā)了可視化Bead，即在Bead多孔性結構中摻入對比劑、或者通過化學修飾在聚合物骨架上連接對比性材料，然后采用磁共振和/或X-射線成像。介入手術過程中，針對具體的患者，可視化Bead實時反饋的分布信息對及時調(diào)整介入操作具有重要意義。

前面已闡述阿霉素DEB治療原發(fā)性肝癌可獲得良好的效益；除此之外，DC Bead負載伊立替康治療大腸癌轉移肝癌初步證實也是安全、有效的[41]；在一些臨床前研究[12、42-43]中，DEB還用于腦癌、胰腺癌及腹膜癌治療，并顯示了良好的效果。

總而言之，載藥后的DC Bead用于局部腫瘤的治療可獲得良好的收益，雖然一些結論仍需大量的隨機對照試驗證實。將來DEB發(fā)展的技術領域可能包括成像性能的開發(fā)、不同類型藥物的負載、適合于腫瘤解剖學結構特征的不同粒徑的設計。

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