人血漿中氫嗎啡酮的LC-MS測定方法及其應用

羅雪梅，丁 黎*，潘寅兵，孫魯寧，饒雅琨，何明楓，王美青，劉存明，錢燕寧*

1中國藥科大學，南京 210009；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南京 210029

鹽酸氫嗎啡酮（Hydromorphone Hydrochloride）是一種阿片類鎮(zhèn)痛劑，主要作用于μ受體，鎮(zhèn)痛效力為嗎啡的8倍，不良反應及依賴潛力同嗎啡，但可用更高的濃度，適宜于癌癥、術(shù)后、軟組織創(chuàng)傷等引起的中強度疼痛[1]。

國內(nèi)外文獻中，測定血漿中氫嗎啡酮的方法有：放射性免疫法測定（RIA）[2]、高效液相電子俘獲檢測法（HPLC-ECD）[3-4]和高效液相二級質(zhì)譜測定法（HPLC-MS/MS）[5-7]。但是，與高效液相二級質(zhì)譜測定法相比，放射性免疫測定法存在選擇性較差，高效液相電子捕獲檢測法存在靈敏度較低的問題。在已報道的高效液相二級質(zhì)譜測定法中，LC-MS/MS分析測定方法可分為兩類：NP-LC-MS/MS法[5-6]和RP-LC-MS/MS法[7]。NP-LC-MS/MS法：應用正相硅膠柱，色譜柱平衡慢，進樣后色譜柱需再平衡10 min，總的分析時間長；色譜柱壽命短，只可保證500次進樣，不適用大量樣品的分析；代謝產(chǎn)物于氫嗎啡酮后出峰，可能會干擾氫嗎啡酮的測定。RP-LCMS/MS法：采用經(jīng)酶水解測定血漿中游離及結(jié)合型氫嗎啡酮總量的方法評價氫嗎啡酮緩釋片在犬體內(nèi)的藥動學特征，但靈敏度低，最低定量下限僅為0.8 ng·mL-1；不適用于人血漿中氫嗎啡酮的測定。除此之外，臨床術(shù)后患者的此類測定也鮮有報道。本文建立了術(shù)后患者血漿中氫嗎啡酮測定的LC-MS方法，定量下限為0.06 ng·mL-1，所建立的HPLC-MS分析方法準確、靈敏、方便、耐用，可用于氫嗎啡酮的人體藥動學研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鹽酸氫嗎啡酮注射液（宜昌人福藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：100401，規(guī)格：2 mg/2 mL）；氫嗎啡酮對照品（由宜昌人福藥業(yè)有限公司提供，批號：081201，純度99.8%）；內(nèi)標納洛酮對照品（由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：1240-9702，純度99.7%）；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司）；醋酸銨、甲酸、乙酸乙酯、碳酸氫鈉等試劑均為分析純（南京化學試劑有限公司）；實驗用水為去離子純凈水。

1.2 儀器

Agilent 1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）：雙高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、四極桿質(zhì)譜檢測器等；色譜工作站：Agilent Chem Station（A 10.02）。

1.3 對照品溶液的配制

精密稱取鹽酸氫嗎啡酮11.60 mg（相當于氫嗎啡酮10.28 mg），置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.028 mg· mL-1的氫嗎啡酮儲備液。取該儲備液適量，依次稀釋至所需濃度。精密稱取鹽酸納洛酮5.98 mg（相當于5.38 mg），置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為538 μg·mL-1的納洛酮儲備液。取該儲備液適量，依次稀釋至所需濃度538 ng·mL-1。

1.4 實驗條件

色譜柱：Hedera ODS-2（dp 5 μm，150 mm×2.1 mm I.D.，江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：5 mmol· L-1醋酸銨水溶液（含1%甲酸）－甲醇（88∶12，v/v）；流速：0.35 mL·min-1；柱溫50℃。選擇性離子檢測（SIM）；電噴霧離子化 （ESI）；離子極性：正離子（Positive）；檢測離子選擇：氫嗎啡酮，[M+H]+m/z 286.2；內(nèi)標（納洛酮），[M+H]+m/z 328.2；傳輸區(qū)電壓：160 V；干燥氣流量：10 L·min-1；霧化室壓力：30 psig；干燥氣溫度：350℃。

1.5 血漿樣品的處理

于10 mL玻璃離心管中，精密加入血漿樣品0.5 mL，內(nèi)標（納洛酮）對照品溶液（537 μg·mL-1）30 μL，旋渦混勻。加入1 mol·L-1飽和碳酸氫鈉溶液0.5 mL，旋渦混勻。加入提取液乙酸乙酯4 mL，旋渦5 min，于4000 r·min-1離心10 min。吸取全部上清液轉(zhuǎn)移至另一10 mL干凈玻璃離心管內(nèi)，于35℃水浴中以氮氣流吹干。提取好的血漿樣品放置于－80℃冰箱中保存。測定前用120 μL流動相溶液復溶，旋渦3 min，于15600 r·min-1高速離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品瓶中，進樣量20 μL，進行LC-MS分析。

1.6 藥代動力學研究

一名男性受試者，體重58 kg，年齡21歲，經(jīng)體檢證明肝、腎功能正常，心電圖正常，符合受試者入選條件并簽署知情同意書，試驗嚴格遵守《赫爾辛基宣言》有關(guān)倫理準則，試驗方案經(jīng)南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。按試驗方案將患者術(shù)后轉(zhuǎn)入麻醉恢復室，當其恢復意識、肌力及反射后，拔除氣管導管。待受試者呼吸穩(wěn)定以及血液動力學穩(wěn)定后，單次靜脈恒速注射鹽酸氫嗎啡酮注射液1.5 mg（將規(guī)格為2 mg/2 mL的注射劑2支，用生理鹽水稀釋至40 mL，給藥速度：90 mL/9 mg·h-1），輸注泵持續(xù)泵注時間為10 min。以開始給藥（0 h）計時，然后于給藥前（0 h）及靜脈注射開始后5、10、15、20、30、45 min和1、2、3、4、6、8 h各時間點分別采集受試者給藥對側(cè)肘靜脈血3 mL，采集的全血立即放入含有穩(wěn)定劑的肝素鈉抗凝管中，3000 r·min-1離心10 min，分離血漿，置-80℃冰箱保存待測。用LC-MS法測定血漿中氫嗎啡酮的濃度，計算藥動學參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜掃描

在電噴霧離子化正離子檢測條件 （傳輸區(qū)電壓：160 V）下，氫嗎啡酮形成的主要離子峰為[M+H]+m/z 286.2，見圖1-A；內(nèi)標（納洛酮）形成的主要離子峰為[M+H]+m/z 328.2，見圖1-B。

圖1 氫嗎啡酮（A）和內(nèi)標納洛酮（B）的質(zhì)譜圖

2.2 特異性考察

在本試驗所采用的色譜條件下（見圖2），氫嗎啡酮的保留時間為2.4 min左右；內(nèi)標（納洛酮）的保留時間為4.3 min左右；氫嗎啡酮和內(nèi)標 （納洛酮）峰形良好，無雜峰干擾測定；本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中氫嗎啡酮的濃度，且靈敏度較高。

圖2 血漿中氫嗎啡酮的LC-MS圖（A）空白血漿；（B）空白血漿加入氫嗎啡酮和內(nèi)標（納洛酮）；（C）受試者靜脈注射氫嗎啡酮后的血漿樣品加內(nèi)標對照品

2.3 標準曲線制備及定量下限

取10 mL離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的氫嗎啡酮對照品溶液后，以氮氣流吹干，加入空白血漿0.5 mL，旋渦混勻，配成含氫嗎啡酮濃度分別為 0.06168、0.2570、1.028、3.084、10.28、20.56、41.12、61.68 ng·mL-1的標準含藥血漿，按 “血漿樣品的處理”項下操作，并同時制備空白血漿樣品，進行LCMS分析，記錄色譜圖，制備標準曲線。計算氫嗎啡酮峰面積As和內(nèi)標峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f對血藥濃度C作權(quán)重回歸計算，得氫嗎啡酮的回歸方程：f=5.57×10-2C+7.6×10-4（r= 0.9982），權(quán)重系數(shù)w=1/C2。結(jié)果顯示，氫嗎啡酮血藥濃度在0.06168～61.68 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.06168 ng·mL-1，信噪比大于10。

2.4 精密度與準確度試驗

制備含氫嗎啡酮濃度分別為 0.1542、3.084、51.40 ng·mL-1的標準含藥血漿，每個濃度各配制5份樣品，按“血漿樣品的處理”項下操作，計算樣品和內(nèi)標峰面積的比值f，將f代入隨行標準曲線方程，計算各樣品的濃度，連續(xù)測定3批樣品，根據(jù)批樣品濃度計算本法的準確度與精密度，結(jié)果見表1，本方法的準確度與精密度符合生物樣品分析要求。

表1 氫嗎啡酮的精密度（RSD，n=5）、準確度、回收率和基質(zhì)效應（n=3）

2.5 提取回收率與基質(zhì)效應試驗

按文獻[7]報道方法考察基質(zhì)效應（ME）和提取回收率，配制并處理含氫嗎啡酮濃度分別為0.1542、3.084、51.40 ng·mL-1的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，作為回收率樣品；另取5個不同來源空白血漿同法處理，取上清液，加入氫嗎啡酮和內(nèi)標標準溶液，配制同上3個質(zhì)量濃度的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，作為介質(zhì)效應樣品和回收率對照樣品；以水代替血漿同法配制并處理同上3個質(zhì)量濃度的標準液，每個濃度平行3份，作為介質(zhì)效應對照樣品。將上述樣品進樣，記錄色譜圖，回收率和介質(zhì)效應樣品峰面積與相應對照品峰面積均值之比即為回收率和介質(zhì)效應值。測得血漿中內(nèi)標納洛酮的回收率為 （80.8±2.9）%（n=15），ME分別為（101.1±2.4）%（n=15），血漿中氫嗎啡酮回收率及ME見表1，結(jié)果表明，本實驗條件下氫嗎啡酮和內(nèi)標的回收率均良好，血漿基質(zhì)對其離子化及測定無影響。

2.6 穩(wěn)定性考察

配制含氫嗎啡酮濃度分別為 0.1542、3.084、51.40 ng·mL-1的標準含藥血漿樣品若干份。其中3份按“血漿樣品的處理”項下操作處理后，立即進樣測定并于進樣器中放置，分別于室溫下放置7 h、反復凍融及冰凍放置2周條件下的穩(wěn)定性；同時考察了待測樣品溶液于進樣器中放置，提取液于室溫放置和殘渣在冰凍條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表2，氫嗎啡酮血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.7 藥代動力學研究

受試者術(shù)后靜脈恒速輸注鹽酸氫嗎啡酮（1.5 mg）后，測得該受試者氫嗎啡酮的血藥濃度－時間曲線見圖3，采用BAPP軟件對受試者的血藥濃度－時間數(shù)據(jù)進行處理，主要藥代動力學參數(shù)為：Cmax11.76 ng·mL-1，Tmax0.167 h，t1/22.6 h，AUC0-85.472 ng·h·mL-1，AUC0-∞6.046 ng·h·mL-1。

表2 LC-MS法測定血漿中氫嗎啡酮的穩(wěn)定性試驗（n=3）

圖3 受試者靜脈注射氫嗎啡酮后氫嗎啡酮的血藥濃度－時間曲線

3 討 論

氫嗎啡酮是阿片類鎮(zhèn)痛藥，可導致阿片類的藥物依賴性。反復使用會產(chǎn)生精神、軀體依賴性[8]，故本試驗僅研究患者單次給藥的藥動學特征。

3.1 色譜柱的選擇

氫嗎啡酮極性較大，試驗初期嘗試使用親水柱（HILIC柱）。但存在如下問題：（1）HILIC柱與反相柱保留機制不同。其中，增加HILIC柱流動相中乙腈的比例，流動相的洗脫能力反而降低，氫嗎啡酮在HILIC柱中保留較弱，需增加乙腈的量以提高保留，但在液質(zhì)聯(lián)用應用過程中，有機溶劑量大于95%時，離子化效率反而降低，質(zhì)譜響應降低。同時，酸堿和醋酸銨對保留的影響不大。（2）氫嗎啡酮存在介質(zhì)效應，采用各種方法仍無法避免。（3）氫嗎啡酮在體內(nèi)有95%經(jīng)葡萄糖醛酸化消除，血漿中氫嗎啡酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物的濃度是氫嗎啡酮的30倍[9]。氫嗎啡酮的二相代謝產(chǎn)物在HILIC柱上色譜峰拖尾嚴重，在源內(nèi)發(fā)生裂解，于氫嗎啡酮樣品峰后出峰，增加了樣品分析的時間和干擾了樣品的測定。（4）HILIC平衡較慢，分析時間長，耐用性不如普通C18柱。因此，選擇C18柱分析氫嗎啡酮生物樣品。

3.2 分析儀器的選擇

文獻[5-7]中報道的LC-MS/MS方法中所達到的最低定量下限為0.8 ng·mL-1，試驗條件摸索時，也嘗試了LC-MS/MS的方法，但并不能通過質(zhì)譜條件的優(yōu)化來提高待測物的響應。這可能是因為氫嗎啡酮的結(jié)構(gòu)屬剛性多環(huán)，環(huán)之間聯(lián)系緊實，在質(zhì)譜中不容易被裂解。選用二級質(zhì)譜中的MRM檢測模式時，為了獲得合適的子離子，通常要選擇較高的碰撞能量，這使得氫嗎啡酮在四級桿中的損失增大。而選擇母離子到母離子的檢測模式時，由于化合物在質(zhì)譜中通過路徑的時間要遠長于在單級質(zhì)譜中的時間，這也使得最終獲得的氫嗎啡酮的響應降低。最終選擇單級質(zhì)譜LC-MS來分析待測物氫嗎啡酮，并獲得了較好的靈敏度。

[1]Murray A,Hagen NA.Hydromorphone[J].J Pain Sympt Manage,2005,29(3):5-66.

[2] Lee JW,Pedersen JE,Moravetz TL,et al.Shepard. Sensitive and specific radioimmunoassaysforopiates using commercially available materials.I:Methods for the determinations of morphine and hydromorphone[J].J Pharm Sci,1991,80(3):284-8.

[3] Wetzelsberger N,Lücker PW,Erking W.High-pressure liquid chromatographic method for the determination of hydromorphone in human plasma with electrochemical detection[J].Arzneimittelforschung,1986,36(11):1707-10.

[4] Bouquillon AI,Freeman D,Moulin DE.Simultaneous solid-phase extraction and chromatographic analysis of morphine and hydromorphone in plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection[J].J.Chromatogr,1992,577(2):354-7.

[5] Weng ND,Jiang XY,Newland K,et al.Development and validation of a sensitive method for hydromorphone in human plasma by normal phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].JPharm Biomed Anal,2000,23(4):697-704.

[6] Chen YL,Hanson GD,Jiang XY,et al.Simultaneous determination ofhydrocodone and hydromorphone in human plasma by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J].J Chromatoqr B,2002, 769(1):55-64.

[7] 李曉燕，陳笑艷，涂靜華，等.LC-MS/MS法測定畢格犬血漿中氫嗎啡酮 [J].質(zhì)譜學報，2003，24：89-90.

[8] 陳 磊，尹 萍，邱 毅，等.鹽酸氫嗎啡酮身體依賴性潛力 [J].中國藥物依賴性雜志，2008，17（5）：344-7.

[9] Hagen N,Thirlwell MP,Dhaliwal HS,et al.Steadystate pharmacokinetics of hydromorphone and hydromorphone-3-glucuronide in cancer patients after immediate and controlled-release hydromorphone[J].J Clin Pharmaco,1995,35(1):37-44.