洞穴魚類眼部退化機(jī)制的研究進(jìn)展

顧 嫻, 寧 眺, 肖 蘅

(1. 云南大學(xué) 云南省生物資源保護(hù)與利用重點實驗室, 云南 昆明 650091; 2. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650091)

洞穴魚類眼部退化機(jī)制的研究進(jìn)展

顧 嫻1,2,#, 寧 眺1,2,#, 肖 蘅2,*

(1. 云南大學(xué) 云南省生物資源保護(hù)與利用重點實驗室, 云南 昆明 650091; 2. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650091)

黑暗環(huán)境中的洞穴魚類眼部結(jié)構(gòu)發(fā)生了退化, 但不同洞穴魚物種眼部退化程度存在差異, 從眼部結(jié)構(gòu)的部分缺失到完全消失的情況均存在。目前研究表明, 不論是達(dá)爾文的自然選擇學(xué)說, 還是木村資生的中性進(jìn)化理論均不能很好地解釋洞穴魚類眼部退化的產(chǎn)生機(jī)制。洞穴魚類眼部退化是一個復(fù)雜的過程, 若要揭示其機(jī)制需匯集多個學(xué)科的研究優(yōu)勢。該文介紹了國內(nèi)外洞穴魚類眼部退化研究領(lǐng)域的形態(tài)解剖學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、動物行為學(xué)及分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展, 并對洞穴魚眼部退化的研究現(xiàn)狀與發(fā)展提出了一些思考和建議。

洞穴魚類; 眼部; 退化

十八世紀(jì)中期，Schiodte (1849)首次對洞穴生物進(jìn)行了生態(tài)學(xué)劃分, 從而拉開了洞穴生物研究的序幕。洞穴魚是一類重要的洞穴生物?！岸囱~類”廣義上指生活在洞穴以及類似洞穴環(huán)境下的魚形動物; 狹義則指陸地生態(tài)系統(tǒng)中生活在常年有水的巖溶洞穴以及地下河、湖等生態(tài)環(huán)境中的魚類 (Zhao＆ Zhang, 2009)。本文主要探討生活于洞穴或地下水環(huán)境中, 并表現(xiàn)出適應(yīng)性特征的狹義洞穴魚類。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明, 全世界目前有記述的洞穴魚類共122種, 分屬10目(鯉形目、脂鯉目、鲇形目、電鰻目、鮭鱸目、鼬鳚目、鳉形目、合鰓魚目、鱸形目和鲉形目)19科53屬, 其中鯉形目的洞穴魚種類最豐富(Zhao & Zhang, 2009)。鯉形目洞穴魚主要分布于中國西南及泰國等地區(qū)。鲇形目、脂鯉目等其他洞穴魚主要分布在巴西、墨西哥、馬達(dá)加斯加等熱帶國家和地區(qū)。

洞穴魚類通常由于體表色素與鱗片的消失而呈現(xiàn)半透明狀的身體特征, 從而引起人們的關(guān)注及研究興趣(Vandel, 1965)。隨著研究的深入, 人們發(fā)現(xiàn)除身體半透明外, 洞穴魚類往往缺少眼部結(jié)構(gòu)(即便有殘留的眼部結(jié)構(gòu), 也喪失或基本喪失了辨色的視錐細(xì)胞), 但它們的觸須和側(cè)線系統(tǒng)卻高度發(fā)達(dá), 有些種類，甚至演變出一些特殊的感覺結(jié)構(gòu),如：犀角金線鲃(Sinocyclooheilus rhinocerous)等在頭背交界處形成的特殊角狀結(jié)構(gòu)。洞穴魚類的眼部退化是自然選擇的結(jié)果, 然而，無法用經(jīng)典的達(dá)爾文自然選擇學(xué)說加以解釋, 因為有眼與無眼的洞穴魚并非在黑暗環(huán)境中均同時存在, 而無眼的洞穴魚更適應(yīng)黑暗環(huán)境，所以“適者生存”下來。真實的情況是眼睛器官是否存在并不影響洞穴魚的生存, 洞穴魚眼部退化似乎更像是一種“用進(jìn)廢退”現(xiàn)象。1968年，木村資生提出中性突變理論, 認(rèn)為在分子水平上, 大多數(shù)的物種進(jìn)化和種內(nèi)變異是通過那些對選擇呈中性或近中性的等位基因突變的遺傳漂變而非自然選擇所引起 (Kimuram, 1968)。然而, 迄今洞穴魚視覺相關(guān)基因研究并未發(fā)現(xiàn)等位基因的突變, 中性進(jìn)化理論也未能解釋洞穴魚類眼部退化的原因。目前, 洞穴魚類眼部退化機(jī)制仍無定論。這個領(lǐng)域的研究或許會引導(dǎo)我們對目前已有的某種進(jìn)化理論進(jìn)行補充修訂, 甚至發(fā)現(xiàn)和建立一種新的物種進(jìn)化理論。

1 形態(tài)解剖學(xué)研究進(jìn)展

生物學(xué)領(lǐng)域的早期研究大多是以描述、記錄、歸類的方法對實驗材料進(jìn)行外部形態(tài)觀察及內(nèi)部構(gòu)造解剖開始。在最初洞穴魚類眼部退化的形態(tài)解剖學(xué)研究中, 科學(xué)家們借助低倍光學(xué)顯微鏡觀察認(rèn)為長期在暗環(huán)境中生活的這些魚類的眼部結(jié)構(gòu)高度退化且視覺和感光功能完全喪失。隨著形態(tài)解剖學(xué)研究技術(shù)的不斷進(jìn)步, 早期的低倍光學(xué)顯微鏡粗略觀察漸漸被高倍光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、電子顯微鏡等精確觀察所取代(Yang, 1992),

觀察的對象也由表及里, 深入到細(xì)胞器的層面(Liu& Zheng, 1997)。借助高倍光學(xué)顯微鏡科學(xué)家們揭示了洞穴魚眼部構(gòu)造的真實情況, 雖然洞穴魚類眼部被表皮覆蓋, 被脂肪填充(Nguyen-Legros et al,1987), 但視網(wǎng)膜仍有殘留(Zilles et al, 1983)。隨后的超薄切片顯微觀察結(jié)果指出，洞穴魚的視網(wǎng)膜中沒有可辨色的視錐細(xì)胞, 但可感光的視桿細(xì)胞有所殘留(Kos et al, 2001), 這與正常魚類的視網(wǎng)膜同時含有視桿和視錐細(xì)胞的情況相異(Li ＆ Tao,2002)。除依賴殘存的視桿細(xì)胞進(jìn)行感光外, 洞穴魚還借助松果體中殘留的感光細(xì)胞對光做出一定反應(yīng)。松果體是哺乳動物腦內(nèi)的一種重要神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)換器(Fan et al, 2001)。硬骨魚的松果體不但具有內(nèi)分泌功能, 還具有感光作用, 因此，又被稱作頂眼或者退化的第三只眼(Wang et al, 1994)。通過高倍光學(xué)顯微鏡的精細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)洞穴魚類的松果體也存在不同程度的退化, 但顯微鏡下仍可以分辨出殘存的感光細(xì)胞(Besharse & Hollyfield, 1976; McNulty,1978)。進(jìn)一步利用電子顯微鏡對洞穴魚與地表硬骨魚松果體感光細(xì)胞的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖比較發(fā)現(xiàn), 洞穴魚類松果體中的感光細(xì)胞外節(jié)的結(jié)構(gòu)與地表生活的硬骨魚存在明顯區(qū)別(Herwig, 1976;Kos & Bulog, 2000)。除了眼部構(gòu)造的變化, 洞穴魚類顱面中與眼部相關(guān)聯(lián)的一些骨骼結(jié)構(gòu), 如圍眶骨系也發(fā)生了改變而異于地表的硬骨魚類(Jeffery,2008; Yamamoto et al, 2003)。然而, 無論是最初通過光學(xué)顯微鏡看到洞穴魚退化的眼部被膜覆蓋, 還是后期通過電子顯微鏡揭示洞穴魚退化眼部的細(xì)胞組成異常, 以及與眼部感光有關(guān)聯(lián)的嗅球細(xì)胞比地表普通魚類增多等現(xiàn)象, 都是洞穴魚類眼部退化的表象觀察結(jié)果, 尚屬于定性的形態(tài)解剖研究。近幾年, 形態(tài)解剖學(xué)發(fā)展出一種全新的形態(tài)計量術(shù)。該技術(shù)運用數(shù)學(xué)原理, 利用圖像分析儀對生物組織和細(xì)胞進(jìn)行二維或三維的形態(tài)學(xué)測量, 從而使得形態(tài)解剖學(xué)研究由定性階段發(fā)展到了定量階段(Peng,2009)。形態(tài)計量等定量型的新技術(shù)的運用必將推動洞穴魚類眼部退化的形態(tài)解剖學(xué)研究向更科學(xué)、更精準(zhǔn)的方向發(fā)展。

2 發(fā)育生物學(xué)研究進(jìn)展

對于脊椎動物而言, 眼部發(fā)育的一個特征是眼泡的出現(xiàn)(Jeffery, 2005)。隨著眼泡的出現(xiàn), 外胚層的細(xì)胞開始分裂分化, 在向心端的位置伸展形成視柄, 另一末端的細(xì)胞形成視杯, 同時, 位于外胚層的視泡邊緣的細(xì)胞開始變厚形成晶狀體基板(Jeffery, 2005; Yang, 2008)。在稍后的發(fā)育時期中,胚胎的每個組織都會從干細(xì)胞得到大量高度分化的細(xì)胞, 每個干細(xì)胞在不對稱的分化成一個體細(xì)胞和一個干細(xì)胞后會停止分化, 新生的干細(xì)胞則繼續(xù)這一過程。然而, 硬骨魚的眼部發(fā)育稍有不同, 其眼部細(xì)胞的生長貫穿細(xì)胞的一生, 因而它們的眼睛才能與身體同比例增長(Durand, 1976; Espinasa &Jeffery, 2006)。

顯微注射技術(shù)是發(fā)育生物學(xué)中最經(jīng)典且應(yīng)用最廣泛的實驗技術(shù), 該技術(shù)可以對胚胎發(fā)育過程進(jìn)行定位觀察, 并且通過顯微注射技術(shù)可以將外源物質(zhì)引入到發(fā)育中的胚胎, 研究目的基因的表達(dá)對各個器官的作用(Chen, 1995)。因此，顯微注射技術(shù)很早就被運用到洞穴魚眼部退化的發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域。Cahn（1958)比較研究洞穴魚與地表魚(地表魚是一個相對概念, 指生活于地表水體且表型不具有洞穴適應(yīng)特征的魚類)的胚胎發(fā)育過程后提出洞穴魚的眼睛是隨著身體發(fā)育過程而逐漸消失的。Durand et al（1993)運用顯微注射技術(shù)對洞穴魚類胚胎發(fā)育過程進(jìn)行定位觀察, 進(jìn)一步證實了洞穴魚類的眼部退化伴隨著身體發(fā)育而進(jìn)行。洞穴魚并非像最初設(shè)想的那樣從胚胎期就不存在眼部構(gòu)造。真實情況是, 在胚胎發(fā)育初期, 同物種的地表類型和洞穴類型都遵循正常的眼部發(fā)育的過程。經(jīng)過一段時期的發(fā)育后, 洞穴類型的晶狀體細(xì)胞最先開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡, 然后細(xì)胞凋亡在整個眼部組織蔓延。到洞穴魚成體發(fā)育成熟時, 其眼部已完全被其他迅速分化發(fā)育的組織填充或者包埋(Strickler et al, 2007;Tian & Price, 2005)。上述研究中觀察到洞穴魚眼部最早的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在晶狀體中, 這一現(xiàn)象提示晶狀體可能是控制眼部發(fā)育和退化的重要構(gòu)件。通過顯微注射結(jié)合晶狀體移植手術(shù), 研究者互換處在相同發(fā)育時期的同物種的地表類型和洞穴類型的晶狀體, 洞穴類型能發(fā)育出正常的眼部表型, 而地表類型眼部細(xì)胞開始凋亡。若在地表類型的眼部開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時, 再將原來的晶狀體換回來, 則地表類型的眼部發(fā)育又恢復(fù)。這一結(jié)果證實了晶狀體是控制眼部發(fā)育和退化的重要構(gòu)件(Jeffery, 2005,2009; Strickler et al, 2007)。然而, 晶狀體并非是控制眼部細(xì)胞凋亡的唯一控件, 研究顯示晶狀體可能是通過與視網(wǎng)膜色素上皮的相互作用來調(diào)節(jié)眼部凋亡的進(jìn)程(Strickler et al, 2007)。

3 行為學(xué)研究進(jìn)展

動物行為學(xué)研究動物對環(huán)境的應(yīng)激性以及動物間的溝通、社交、學(xué)習(xí)、繁殖、情緒表達(dá)等(Shang,1998, 2005)。長期生活于暗環(huán)境的洞穴魚類, 其行為表現(xiàn)明顯異于地表魚類, 已經(jīng)發(fā)展出完全適應(yīng)黑暗環(huán)境的覓食、攻擊、繁殖等行為。由于洞穴魚類實驗材料的特殊性, 如生境不易發(fā)現(xiàn)和進(jìn)入, 以及活體樣本極難在實驗條件下成活等因素, 使得洞穴魚類眼部退化的行為學(xué)研究十分困難。目前僅有簡單光線刺激下洞穴魚行為表現(xiàn)的少量報道?？茖W(xué)家研究指出，在同樣黑暗模擬環(huán)境中, 地表魚類顯得更加好斗和不安; 而同樣光照模擬環(huán)境中, 洞穴魚類成體卻沒有強(qiáng)烈的行為改變(Alunni et al, 2007)。更有意思的是陰影反應(yīng)實驗中, 洞穴魚幼體的反應(yīng)行為模式更接近于兩棲動物幼體而異于硬骨魚類(Yoshizawa & Jeffery, 2008), 且洞穴魚幼體比成體對光線的敏感度更強(qiáng), 洞穴魚對光環(huán)境的應(yīng)激行為似乎呈現(xiàn)出隨著身體成熟度增加而逐漸減弱消失的趨勢(Espinasa et al, 2005; Kos et al, 2001)。行為學(xué)的研究結(jié)果從另一方面支持了發(fā)育生物學(xué)研究得出的結(jié)論——洞穴魚類的眼部退化是伴隨身體發(fā)育進(jìn)行的。除了洞穴魚個體成熟度不同對光環(huán)境的反應(yīng)呈現(xiàn)差異外, 洞穴魚對光源類型及光源照射位置的反應(yīng)也不同。洞穴魚類對集中型光源的應(yīng)激反應(yīng)更快(Strickler et al, 2007), 尤其當(dāng)光線直接照射在其大腦松果體所在的位置(Yoshizawa & Jeffery,2008)。然而, 洞穴魚類對光源刺激的行為模式、產(chǎn)生機(jī)理以及復(fù)雜實驗環(huán)境刺激下的行為表現(xiàn)及神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)性等較深層次的行為學(xué)研究尚未開展。因此, 洞穴魚眼部退化與行為改變間到底遵從哪種發(fā)展關(guān)系：是眼部退化導(dǎo)致了洞穴魚的行為改變，還是行為改變加速了眼部退化的進(jìn)程，抑或是眼部退化與行為改變一直相互影響相互作用。至今這些問題仍是未解之謎。

4 分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

分子遺傳學(xué)是在分子的結(jié)構(gòu)、功能及相互關(guān)系的基礎(chǔ)上來研究生物遺傳與變異機(jī)制的遺傳學(xué)分支學(xué)科(Luo, 1997)。分子遺傳學(xué)的發(fā)展依賴于分子生物學(xué)實驗技術(shù)的不斷進(jìn)步。近30年, 分子生物學(xué)實驗技術(shù)發(fā)展非常迅速, 因而分子遺傳學(xué)成為了洞穴魚類視覺退化研究中起步最晚而發(fā)展最快的方向。根據(jù)分子遺傳學(xué)理論, 洞穴魚視覺相關(guān)基因的功能改變或表達(dá)通路問題很可能是引起洞穴魚視覺退化的關(guān)鍵。因此，最初洞穴魚視覺退化的分子遺傳學(xué)研究重點是比較洞穴魚與地表魚在視覺相關(guān)基因上的序列差異, 找到視覺相關(guān)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)的突變位點。通過對比墨西哥麗脂鯉(Astyanax mexicanus)的地表類群和洞穴類群的幾種視覺相關(guān)基因的分子序列, 發(fā)現(xiàn)兩個群體中相同基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)并無變異(Yokoyama &Yokoyama, 1990), 而將兩個群體的晶狀體蛋白、pax6、Rx、Chx、Vax等對眼部有重要作用的基因的cDNA序列與斑馬魚(Brachydanio rerio)等其他魚類的相同基因的cDNA序列進(jìn)行比較時, 發(fā)現(xiàn)這些基因cDNA序列的魚類特定區(qū)域是同源性的。這說明洞穴魚眼部退化并不遵循中性進(jìn)化。因為中性進(jìn)化理論認(rèn)為中性突變對生物的生存和繁殖沒有影響, 自然選擇對它們不起作用, 突變在種群中的保存、擴(kuò)散、消失完全隨機(jī)。加之洞穴魚的群體通常都很小, 如果其視覺退化符合中性進(jìn)化理論, 那么視覺相關(guān)基因的漂變速度應(yīng)該很快, 就會在1～2代后出現(xiàn)某些基因的固定和另一些基因的消失。而實際研究情況是洞穴魚與其它魚類的視覺相關(guān)基因的cDNA序列的魚類特定區(qū)域高度同源。于是洞穴魚類分子遺傳學(xué)研究的重點開始轉(zhuǎn)向眼部發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)模式, 包括表達(dá)的位點變化、表達(dá)的時間不同以及表達(dá)量的多少。在表達(dá)研究中這幾種視覺相關(guān)基因在墨西哥麗脂鯉地表與洞穴群體中的表達(dá)方式呈現(xiàn)出差異(Behrens et al, 1998;Strickler et al, 2002; Tian et al, 2005)。除了視覺相關(guān)基因的表達(dá)模式的研究之外, 基因鏈鎖圖譜成為洞穴魚類分子遺傳學(xué)研究的另一個新方向。國外研究者通過分析比較墨西哥麗脂鯉的洞穴類型和地表類型雜交后代的基因鏈鎖圖譜, 提出洞穴魚的眼部退化是多基因作用的過程(Strickler & Jeffery,2009)。

目前洞穴魚視覺研究主要集中在對眼部發(fā)育有重要作用的以下幾個基因或基因家族中。1)最先引起人們的注意是 Hedgehog（hh）信號基因。Hedgehog信號能夠調(diào)控多種器官的發(fā)育。hh信號基因是Hammerschmidt等人首先在果蠅胚胎中發(fā)現(xiàn)的控制信號通路的基因(Wang et al, 2011)。該信號基因在硬骨魚中有兩個同源基因：shh和twhh(Ekker et al, 1995), 它們有重疊的表達(dá)模式。與地表魚不同的是, 許多洞穴魚的這兩個基因在胚胎中線位置的表達(dá)區(qū)域都有一個擴(kuò)充的現(xiàn)象。如果對地表魚的胚胎注射這兩個基因的mRNA, 成體地表魚的眼部會消失，這說明這兩個基因的擴(kuò)充表達(dá)對眼部發(fā)育有阻礙的作用。同時發(fā)現(xiàn)在洞穴魚晶狀體的凋亡過程中shh信號基因的作用更為重要(Yamamoto et al,2004)。2)Pax基因家族。該基因家族受hh信號基因調(diào)控, 編碼128個氨基酸且在進(jìn)化上保守(Pan &Yuan, 1997), 其表達(dá)的蛋白質(zhì)對動物胚胎時期的器官發(fā)育有重要作用。家族中的 pax6對眼部發(fā)育作用很大(An et al, 2005; Liu et al, 2004)。通過對比洞穴魚的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn), 與hh基因不同, pax6的表達(dá)較為緩和(Behrens et al, 1997; Strickler et al, 2001),即在表達(dá)位置的表達(dá)程度有所減弱。3)Prox1基因。由于該基因在許多器官都有表達(dá), 所以人們推測這個基因可能也受到hh信號基因的調(diào)控。在金魚的prox1表達(dá)研究中, 人們發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期金魚眼部該基因的表達(dá)模式有所不同(Jeffery et al, 2000;Ma et al, 2007), 提示prox1基因在不同發(fā)育時期的作用可能不同。Prox1基因在洞穴魚的嗅球和神經(jīng)丘的表達(dá)有所擴(kuò)充, 但在眼部發(fā)育中該基因的表達(dá)是正常的, 這說明在嗅球等器官上prox1有重要作用。4)Hsp熱休克蛋白。該蛋白對于處于不良環(huán)境下的生物體細(xì)胞具有保護(hù)作用(Sun, 1997), 且按相對分子質(zhì)量大小分為hsp90、hsp70、hsp60 及小hsp四個家族(Morimoto et al, 1990)。Hsp70在同種魚類的洞穴類型和地表類型的晶狀體中的表達(dá)模式相同, 而hsp90編碼的一種hsp90β亞型在兩者的晶狀體中沒有表達(dá), 另一種hsp90α亞型只在洞穴群體的晶狀體中表達(dá)且在晶狀體凋亡之前會出現(xiàn)一個表達(dá)高峰, 提示該亞型在洞穴魚的晶狀體凋亡的過程中可能具有重要作用(Hooven et al, 2004)。

5 總結(jié)與展望

洞穴魚的奇異外形引起了人們極大的興趣, 從中世紀(jì)開始就有相關(guān)的記錄資料。然而, 由于洞穴環(huán)境復(fù)雜, 采樣非常困難, 使得洞穴魚的研究發(fā)展緩慢。同時洞穴魚類很難像其他魚類一樣人工繁殖和馴養(yǎng), 這無疑加大了研究的困難性。目前僅有墨西哥麗脂鯉一種洞穴魚被成功馴化成觀賞魚類, 其余洞穴魚多被列為保護(hù)物種。這也是限制洞穴魚研究的另一個重要因素。即便在生物技術(shù)蓬勃發(fā)展的21世紀(jì), 洞穴魚的研究多數(shù)仍集中在樣品易獲取的墨西哥麗脂鯉的發(fā)育學(xué)、胚胎學(xué)、組織解剖學(xué), 以及少數(shù)洞穴魚, 如金線鲃等的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上。洞穴魚類的進(jìn)化是一個復(fù)雜的過程, 需要系統(tǒng)性研究。然而, 目前尚無任何一個進(jìn)化學(xué)說能夠很好解釋洞穴魚類的進(jìn)化及其眼部的退化。開展洞穴魚類眼部退化機(jī)制的研究, 能夠讓研究者更深刻的理解動物的表型進(jìn)化與基因之間的聯(lián)系, 或許能夠促進(jìn)某種舊進(jìn)化理論的修訂以及一個新進(jìn)化理論的建立。中國擁有全世界最豐富的洞穴魚類資源, 充分利用和保護(hù)好資源優(yōu)勢, 緊跟世界進(jìn)化研究的步伐, 我國科研工作者便可在洞穴魚類眼部退化的研究中有所成就。針對目前洞穴魚類研究現(xiàn)狀, 筆者提出今后洞穴魚類研究中需要注意的以下幾方面內(nèi)容。

5.1 發(fā)展采樣手段, 豐富研究材料

魚類采集的常規(guī)方法很多, 如竿釣、撒網(wǎng)、電擊等。通常這些方法只適合于在水域較寬的環(huán)境中使用, 而且對樣品具有一定損傷。由于洞穴環(huán)境復(fù)雜特殊, 且洞穴魚生命力較脆弱, 上述方法并不適用于洞穴魚的采集。為了獲得豐富的洞穴魚研究材料, 可以根據(jù)洞穴魚的以下特點, 發(fā)展切實可行的采樣手段。首先, 雨季時期洞穴魚類會隨地下暗河水位升高而進(jìn)入相鄰的洞穴水域, 這是采集洞穴魚的最佳時期。在這個時期進(jìn)入洞穴可以增加采樣成功幾率。其次，洞穴地下河中往往食物稀缺, 設(shè)置地籠并輔以食物誘捕有一定效果。再者，洞穴魚類對聲波及光線都比較敏感, 通過聲波或光線刺激將魚類向目標(biāo)漁網(wǎng)中驅(qū)趕或引誘, 也能提高采樣效率?？傊? 洞穴魚的采樣方法需結(jié)合洞穴魚的生物特性而設(shè)計, 這樣才能無損傷且有效地增加采樣量,豐富研究材料。

5.2 跨學(xué)科研究, 多種技術(shù)結(jié)合

1904年, 洞穴生物學(xué)這個概念首次被提出(Protas et al, 2008)。從此揭開了洞穴魚類的研究歷史。悉數(shù)以前的研究成果, 從最早的形態(tài)學(xué)和生態(tài)環(huán)境研究到后來的系統(tǒng)分類學(xué)研究, 都是單一學(xué)科的研究手段。單一研究往往無法解決洞穴魚類眼部退化機(jī)制這類復(fù)雜的生物學(xué)問題。要透徹揭示相關(guān)基因在洞穴魚類的眼部退化中的作用, 跨學(xué)科的研究及多種技術(shù)的運用是必經(jīng)之路。相對于其他學(xué)科的研究技術(shù)而言, 分子遺傳學(xué)研究具有對材料的需求量較少且DNA水平的分析不受限于活體樣本的優(yōu)點。加之DNA測序技術(shù)近幾年飛速發(fā)展, 尤其是第二代及第三代高通量測序技術(shù)的發(fā)明和運用使得生物體遺傳信息的獲取速度和準(zhǔn)確性大幅度提升(Sultan et al; Hayden, 2009; Shendure & Ji, 2008)。因而運用高通量測序新技術(shù)獲取洞穴魚基因組的分子遺傳信息(目前尚無任何一種洞穴魚基因組數(shù)據(jù)公布)并從中篩選出與眼部退化相關(guān)的目標(biāo)基因進(jìn)行深入分析是探討洞穴魚類眼部退化機(jī)制的一個突破口。同時, 建立以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ), 生態(tài)學(xué)為導(dǎo)向, 胚胎發(fā)育及神經(jīng)生物學(xué)為驗證的跨學(xué)科多技術(shù)結(jié)合策略, 必將加速洞穴魚類眼部退化機(jī)制領(lǐng)域的研究進(jìn)程。

5.3 注重環(huán)境保護(hù), 攻克人工飼養(yǎng)

洞穴生境能夠孕育很多我們未知的物種，但是由于洞穴環(huán)境的特殊性, 很多研究者未曾涉足的洞穴已經(jīng)開發(fā)成旅游和探險項目。隨著大量的游客涌入, 全天候的燈光照明, 嚴(yán)重的噪聲污染, 使得洞穴環(huán)境受到嚴(yán)重破壞, 而且這種破壞不可恢復(fù), 其中生存的很多物種很可能在人們未了解前就消失。這也是幾乎所有已發(fā)現(xiàn)的洞穴魚類都被列入瀕危物種的原因之一。加強(qiáng)洞穴環(huán)境保護(hù)無疑是避免洞穴魚類滅絕最直接的措施。然而, 目前我國洞穴環(huán)境保護(hù)的實施推廣異常困難, 且能保護(hù)的地區(qū)非常有限。因此, 攻克洞穴魚的人工飼養(yǎng)才能長遠(yuǎn)有效地保護(hù)更多的洞穴魚資源。人工飼養(yǎng)不但有益于保護(hù)洞穴魚, 解決洞穴魚科研上的樣品問題, 而且利于構(gòu)建健康生態(tài)系統(tǒng)(例如, 現(xiàn)已成功構(gòu)建的能有效改善滇池水體環(huán)境的“花(海菜花)——魚(滇池金線鲃)——蚌(無齒蚌)濕地生態(tài)系統(tǒng)”, 創(chuàng)造特色水產(chǎn)養(yǎng)殖效益。我國科研工作者自 2003年就開始摸索滇池金線鲃(Sinocyclocheilus grahami)、犀角金線鲃(Sinocyclocheilus rhinocerous)、大頭金線鲃(Sinocyclocheilus macrocephalus)、尖頭金線鲃(Sinocyclocheilus oxycephalus)、撫仙金線鲃(Sinocyclocheilus tingi)等洞穴魚種的人工繁育技術(shù)。通過模擬洞穴魚天然生活環(huán)境并利用生物學(xué)技術(shù)阻止人工飼養(yǎng)下親魚性腺退化的措施, 上述幾種洞穴魚的人工飼養(yǎng)現(xiàn)已獲得初步成功(Li et al, 2009;Pan et al, 2009; Yan et al, 2010; Yang et al, 2007)。我們堅信不久的將來洞穴魚人工飼養(yǎng)能完全被攻克。一旦洞穴魚人工飼養(yǎng)獲得成功, 經(jīng)濟(jì)價值得以體現(xiàn),就能更好地促進(jìn)洞穴魚的保護(hù)。

Alunni A, Menuet A, Candal E, Pénigault JB, Jeffery WR, Rétaux S. 2007.Developmental mechanisms for retinal degeneration in the blind cavefishAstyanax mexicanus[J].J Comp Neurol,505(2): 221-233.An F, Guan XK, Huang H. 2005. Discussion that PAX6 acts on while the

development take place in the eyes [J].Tibet Sci Tech,150(10): 44-45.[安芳, 關(guān)小康, 黃鶴. 2005. PAX6在眼發(fā)生發(fā)育過程中作用的探討.西藏科技, 150(10): 44-45.]

Behrens M, Langecker TG, Wilkens H, Schmale H. 1997. Comparative analysis of Pax-6 sequence and expression in the eye development of the blind cave fishAstyanax fasciatusand its epigean conspecific [J].Mol Biol Evol,14(3): 299-308.

Behrens M, Wilkens H, Schmale H. 1998. Cloning of the αA-crystallin genes of a blind cave form and the epigean form ofAstyanax fasciatus:a comparative analysis of structure, expression and evolutionary conservation [J].Gene,216(2): 319-326.

Besharse JC, Hollyfield JG. 1976. Renewal of normal and degenerating photoreceptor outer segments in the Ozark cave salamander [J].J Exp Zool,198(3): 287-301.

Cahn PH. 1958. Comparative optic development inAstyanax mexicanusand two of its blind cave derivatives [J].Bull Am Mus Nat Hist,115:75-112.

Chen YZ. 1995. Molecular Neurobiology [M]. Beijing: People's Military Medical Press. [陳宜張. 1995. 分子神經(jīng)生物學(xué). 北京: 人民軍醫(yī)出版社.]

Durand JP. 1976. Ocular development and involution in the European cave salamander,Proteus anguinuslaurenti [J].Biol Bull,151(3): 450-466.

Durand JP, Keller N, Renard G, Thorn R, Pouliquen Y. 1993. Residual cornea and the degenerate eye of the cryptophthalmicTyphlotriton spelaeus[J].Cornea,12(5): 437-447.

Ekker SC, Ungar AR, Greenstein P, von Kessler DP, Porter JA, Moon RT,Beachy PA. 1995. Patterning activities of vertebratehedgehogproteins in the developing eye and brain [J].Curr Biol,5(8): 944-955.

Espinasa L, Jeffery WR. 2006. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration [J].Evol Dev,8(1): 16-22.

Espinasa L, Yamamoto Y, Jeffery WR. 2005. Non-optical releasers for aggressive behavior in blind and blindedAstyanax(Teleostei,Characidae) [J].Behav Processes,70(2): 144-148.

Fan YB, Hou GQ, Wang BZ. 2001. The mammalian pineal gland: Structure and function [J].Chn J Neuroanat,17(1): 91-94. [樊宇兵, 侯廣棋,王保芝. 2001. 哺乳動物松果體的構(gòu)造和功能. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志,17(1): 91-94.]

Hayden EC. 2009. Genome sequencing: the third generation [J].Nature,457(12): 768-769.

Herwig HJ. 1976. Comparative ultrastructural investigations of the pineal organ of the blind cave fish,Anoptichthys jordani, and its ancestor, the eyed river fish,Astyanax mexicanus[J].Cell Tissue Res,167(3):297-324.

Hooven TA, Yamamoto Y, Jeffery WR. 2004. Blind cavefish and heat shock protein chaperones: a novel role for hsp90α in lens apoptosis [J].Int J Dev Biol,48(8-9): 731-738.

Jeffery WR. 2005. Adaptive evolution of eye degeneration in the Mexican blind cavefish [J].J Hered,96(3): 185-196.

Jeffery WR. 2008. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and microevolution of development [J].Evol Dev,10(3): 265-272.

Jeffery WR. 2009. Evolution and Development in the Cavefish Astyanax[M]. Burlington: Academic Press.

Jeffery WR, Strickler AG, Guiney S, Heyser DG, Tomarev SI. 2000.Prox 1in eye degeneration and sensory organ compensation during development and evolution of the cavefishAstyanax[J].Dev Genes Evol,210(5): 223-230.

Kimura M. 1968. Evolutionary rate at the molecular level [J].Nature,217(5129): 624-626.

Kos M, Bulog B. 2000. The ultrastructure of photoreceptor cells in the pineal organ of the blind cave salamander,Proteus anguinus(Amphibia, Urodela) [J].Pfliigers Arch: Eur J Physiol,439(7):175-177.

Kos M, Bulog B, Szél á, R?hlich P. 2001. Immunocytochemical demonstration of visual pigments in the degenerate retinal and pineal photoreceptors of the blind cave salamander (Proteus anguinus) [J].Cell Tissue Res,303(1): 15-25.

Li WX, Gao H, Liu HY, Chen H, Li YH. 2009. Artificial propagation of Sinocyclocheilus [J].Yunnan Agric Sci Technol,(1): 55-57. [李維賢,高慧, 劉漢云, 陳洪, 李云洪. 2009. 金線魚繁殖方法. 云南農(nóng)業(yè)科技, (1): 55-57.]

Li WX, Tao JN. 2002. Local dissection of body of the fishesSinocyclocheilus rhinocerous[J].J Yunnan Agric Univ,17(3): 207-209.[李維賢, 陶進(jìn)能. 2002. 犀角金線鲃的局部解剖. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 17(3): 207-209.]

Liu LY, Zheng GM. 1997. General Zoology [M]. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press. [劉凌云, 鄭光美. 1997. 普通動物學(xué). 3版. 北京:高等教育出版社.]

Liu XY, Fu T, Wang NL. 2004. Pax6 genes and developmental problems in the eye [J].For Med Sci :Ophthalmol,28(4): 217-220. [劉旭陽, 傅濤, 王寧利. 2004. Pax6基因與眼發(fā)育異常. 國外醫(yī)學(xué):眼科分冊,28(4): 217-220.]

Luo J. 1997. Current situation and prospects of animal molecular genetics[J].J Yellow Cattle Sci,23(1): 8-10. [羅軍. 1997. 動物分子遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀與展望. 黃牛雜志, 23(1): 8-10.]

Ma DM, Zhu HP, Gui JF. 2007. Molecular cloning and expression characterization ofprox1in goldfish (Carassius auratus) eye development [J].Zool Res,28(6): 589-596. [馬冬梅, 朱華平, 桂建芳. 2007. 金魚Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛發(fā)育中的表達(dá)分析. 動物學(xué)研究, 28(6): 589-596.]

McNulty JA. 1978. Fine structure of the pineal organ in the troglobytic fish,Typhlichthyes subterraneous(Pisces: Amblyopsidae) [J].Cell Tissue Res,195(3): 535-545.

Morimoto RI, Tissières A, Georgopoulos C. 1990. The stress response,function of the proteins, and perspectives [M]// Stress Proteins in Biology and Medicine. New York: CPHL Press 1990:1670-1678.

Nguyen-Legros J, Durand J, Simon A, Keller N, Vigny A, Dupuy J,Pouliquen Y. 1987. Persistence of retinal dopamine cells in the degenerated eye of the cave salamander,Proteus anguinusL. [J].Ophthalmic Res,19(6): 309-317.

Pan MH, Yuan JG. 1997. Pax-A development important genes related to family [J].J Med Mol Biol,19(2): 49-53. [潘美輝, 袁建剛. 1997.Pax- 一個發(fā)育相關(guān)的重要基因家族. 醫(yī)學(xué)分子生物雜志, 19(2):49-53.]

Pan XF, Liu SW, Li ZY, Yang JX. 2009. Artificial propagation and larvae cultivation ofSinocyclocheilus tingi[J].Zool Res,30(4): 463-467.[潘曉賦, 劉淑偉, 李再云, 楊君興. 2009. 撫仙金線鲃人工繁殖與魚苗培育技術(shù). 動物學(xué)研究, 30(4): 463-467.]

Peng KM. 2009. Animal Histology and Embryology [M]. Beijing: Higher Education Press. [彭克美. 2009. 動物組織學(xué)及胚胎學(xué). 北京: 高等教育出版社.]

Protas M, Tabansky I, Conrad M, Gross JB, Vidal O, Tabin CJ, Borowsky R.2008. Multi-trait evolution in a cave fish,Astyanax mexicanus[J].Evol Dev,10(2): 196-209.

Schiodte JC. 1849. Specimen Faunae Subterraneae. Bidrag Til den Underjordiske Fauna [M]. Copenhagen: Kjobenhavn.

Shang YC. 1998. Behavioral Ecology [M]. Beijing: Peking University Press.[尚玉昌. 1998. 行為生態(tài)學(xué). 北京: 北京大學(xué)出版社.]

Shang YC. 2005. Ethology [M]. Beijing: Peking University Press. [尚玉昌. 2005. 動物行為學(xué). 北京: 北京大學(xué)出版社.]

Shendure J, Ji H. 2008. Next-generation DNA sequencing [J].Nat Biotechnol, 26(10): 1135-1145.

Strickler AG, Famuditimi K, Jeffery WR. 2002. Retinal homeobox genes and the role of cell proliferation in cavefish eye degeneration [J].Int J Dev Biol,46(3): 285-294.

Strickler AG, Jeffery WR. 2009. Differentially expressed genes identified by cross-species microarray in the blind cavefishAstyanax[J].Int Zool,4(1): 99-109.

Strickler AG, Yamamoto Y, Jeffery WR. 2001. Early and late changes in Pax6 expression accompany eye degeneration during cavefish development [J].Dev Genes Evol,211(3): 138-144.

Strickler AG, Yamamoto Y, Jeffery WR. 2007. The lens controls cell survival in the retina: evidence from the blind cavefishAstyanax[J].Dev Biol,311(2): 512-523.

Sultan M, Schulz MH, Richard H, Magen A, Klingenhoff A, Scherf M,Seifert M, Borodina T, Soldatov A, Parkhomchuk D, Schmidt D,O'Keeffe S, Haas S, Vingron M, Lehrach H, Yaspo ML. 2008. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome [J].Science, 321(5891): 956-960.

Sun JJ. 1997. The distribution of hsp70, adjust and function [J].For Med Sci:Pathophysiol Clin Med, 17(1): 7-10. [孫經(jīng)建. 1997. 熱休克蛋白70 的分布、調(diào)節(jié)及功能. 國外醫(yī)學(xué): 生理、病理科學(xué)與臨床分冊,17(1): 7-10.]

Tian NMML, Price DJ. 2005. Why cavefish are blind [J].BioEssays,27(3):235-238.

Vandel A. 1965. Biospeleology: the Biology of Cavernicolous Animals [M].Oxford: Pergamon Press.

Wang DQ. 1994. A study on microscopic structure and ultrastructure of the pineal body in a teleost fish (Carassius Auratus) [J].Acta Hydrobiol Sci,18(1): 22-25. [王典群. 1994. 鯽魚松果體的顯微和超微結(jié)構(gòu)研究. 水生生物學(xué)報, 18(1): 22-25.]

Wang QL, Su L, Liu XG. 2011. Relationship between Hedgehog signaling pathway and related tumors [J].J Chem Life,31(1): 21-26. [王琪琳,蘇玲, 劉相國. 2011. Hedgehog信號通路與腫瘤. 生命的化學(xué), 31(1):21-26.]

Yamamoto Y, Espinasa L, Stock DW, Jeffery WR. 2003. Development and evolution of craniofacial patterning is mediated by eye-dependent and-independent processes in the cavefishAstyanax[J].Evol Dev,5(5):435-446.

Yamamoto Y, Stock DW, Jeffery WR. 2004. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish [J].Nature,431(7010): 844-847.

Yan H, Tu SH, Dong WH, Yang RL. 2010. Study on the artificial propagation ofSinocyclocheilus grahamin Dianchi lake [J].J Hydrocolloid,3(1): 138-141. [嚴(yán)暉, 涂書浩, 董文紅, 楊瑞林. 2010.滇池金線鲃全人工繁殖研究. 水生態(tài)學(xué)雜志, 3(1): 138-141.]

Yang AF. 1992. Vertebrate Zoology [M].2nded. Beijing: Peking University Press. [楊安峰. 1992. 脊椎動物學(xué).2 版. 北京: 北京大學(xué)出版社.]

Yang JX, Pan XF, Li ZY. 2007. Preliminary report on the successful breeding of the endangered fishSinocyclocheilus grahamiendemic to Dianchi lake [J].Zool Res,28(3): 329-331. [楊君興, 潘曉賦, 李再云. 2007. 云南滇池瀕危特有種滇池金線鲃人工繁殖初報. 動物學(xué)研究, 28(3): 329-331.]

Yang TJ. 2008. Pax6 Expression in the Developmental Eyes ofBufo raddei Strauchand the Histology Features and Functions of Chief Parts of Eyeball in the Bactrian Camels [D]. Master thesis, Lanzhou University,Lanzhou. [楊唐軍. 2008. 花背蟾蜍 (Bufo raddei Strauch) 眼發(fā)育過程中 Pax6的表達(dá)及雙峰駝 (Camelus bactrianus) 眼的組織學(xué)研究. 蘭州大學(xué), 蘭州.]

Yokoyama R, Yokoyama S. 1990. Solation, DNA sequence and evolution of a color visual pigment gene of the blind cave fishAstyanax fasciatus[J].Vision Res,30(6): 807-816.

Yoshizawa M, Jeffery WR. 2008. Shadow response in the blind cavefishAstyanaxreveals conservation of a functional pineal eye [J].J Exp Biol,211(3): 292-299.

Zhao YH, Zhang CG. 2009. Endemic Fishes ofSinocyclocheilus(Cypriniformes: Cyprinidae) in China－Species diversity, Cave adaptation, Systematics and Zoogeography [M]. Beijing: China Science Press. [趙亞輝, 張春光. 2009. 中國特有金線鲃屬魚類——物種多樣性、洞穴適應(yīng)、系統(tǒng)演化和動物地理. 北京: 科學(xué)出版社.]

Zilles K, Tillmann B, Bennemann R. 1983. The development of the eye inAstyanax mexicanus(Characidae, Pisces), its blind cave derivative,Anoptichthys jordani(Characidae, Pisces), and their crossbreds. A scanning- and transmission-electron microscopic study [J].Cell Tissue Res,229(2): 423-432.

Progress on the degeneration mechanism of cave fishes’ eyes

GU Xian1,2,#, NING Tiao1,2,#, XIAO Heng2,*

(1.Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources,Yunnan University,Kunming650091,China;2.School of Life Sciences,Yunnan University,Kunming650091,China)

Attempts to understand the degeneration of the eyes in cave fish has largely been explained by either various extents of gradual degeneration, ranging from partial to total loss, observed in various species or by acceleration of loss caused by dark environments. However, neither the theory of biological evolution developed by Charles Darwin nor the neutral theory of molecular evolution formulated by Kimura Motoo adequately explains these phenomena. Recent trends in utilizing multidisciplinary research, however, have yielded better results, helping reveal a more complex picture of the mechanisms of degeneration. Here, we summarize the current progress of the research via morphology and anatomy, development biology, animal behavior science and molecular genetics, and offer some perspectives on the ongoing research into the development and degeneration of eyes in cave fish.

Cave fishes; Eyes; Degeneration

Q959.499; Q951;Q958.8

A

0254-5853-(2012)04-0409-07

10.3724/SP.J.1141.2012.04409

2011-12-26；接受日期：2012-06-25

云南大學(xué)第三屆研究生科研課題項目(YNUY201035); 國家“973”項目(2007CB411600)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: xiaoheng@ynu.edu.cn

#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)

顧嫻(1986－), 女, 碩士研究生, 主要研究方向: 動物學(xué), E-mail: gx.ff@163.com; 寧眺(1978－), 女, 博士, 講師, 主要研究方向:動物分子遺傳與進(jìn)化, E-mail: tiaoning@ynu.edu.cn