文昌魚tropomyosin基因的克隆、進化分析及其胚胎發(fā)育與成體中的表達模式

李忻怡, 林浴霜, 張紅衛(wèi)

(1. 陜西師范大學 生命科學學院, 西安 710062; 2. 山東大學 生命科學學院, 濟南 250100)

文昌魚tropomyosin基因的克隆、進化分析及其胚胎發(fā)育與成體中的表達模式

李忻怡1,2,*, 林浴霜2, 張紅衛(wèi)2

(1. 陜西師范大學 生命科學學院, 西安 710062; 2. 山東大學 生命科學學院, 濟南 250100)

Tropomyosin是一種分布廣泛而且在進化上十分保守的蛋白, 是肌肉形成和收縮過程中重要的調節(jié)蛋白質。通過RT-PCR和RACE技術得到文昌魚tropomyosin基因全長, 編碼一個含284個氨基酸殘基的蛋白質, 將文昌魚 Tropomyosin和在其他物種中的同源物進行比對建樹, 發(fā)現其在功能域上高度保守并且只有一個拷貝, 符合動物分類學中各物種的進化地位。胚胎整體原位雜交實驗得知,tropomyosin在文昌魚早期發(fā)育的表達，最早從原腸胚末期神經胚早期開始, 定位于分化中的中內胚層。到神經胚期,tropomyosin的表達出現在發(fā)育中的體節(jié)和脊索中。隨著發(fā)育的進行,tropomyosin的表達穩(wěn)定地集中在體節(jié)、脊索處。到72 h幼蟲階段,tropomyosin的表達仍然在肌節(jié)內。成體的切片原位雜交結果顯示,tropomyosin在肌節(jié)中的表達大幅度下調, 而在神經管細胞、脊索和腮區(qū)腮瓣處仍然可以檢測到明顯的表達, 在外胚層和表皮內沒有發(fā)現雜交信號。研究結果表明,tropomyosin的表達與文昌魚肌節(jié)、肌肉以及神經索的發(fā)生相關, 參與文昌魚胚胎軀體模式的構建, 而且在成體的生命活動中發(fā)揮重要作用。

文昌魚; 進化分析; 胚胎發(fā)育; 表達圖式; Tropomyosin

肌肉是脊椎動物胚胎發(fā)育中最早出現的組織之一。研究肌肉的發(fā)生機制是了解胚胎發(fā)育中細胞命運的決定、分化及器官形成的重要途徑。研究文昌魚肌肉發(fā)育過程, 有助于闡明脊椎動物肌肉發(fā)生的機制。

從胚胎發(fā)育過程來看文昌魚具有和脊椎動物一樣的分節(jié)過程。原腸運動后, 脊椎動物 (爪蛙除外) 胚胎的肌肉發(fā)生也是從位于脊索兩側的近軸中胚層按從前到后的順序分節(jié) (segmentation)、成團,逐漸形成一定數目的體節(jié) (somites), 再由體節(jié)分化出3種不同的組織：生骨節(jié)、生肌節(jié)、生皮節(jié), 將來分別生成骨骼、肌肉以及真皮和結締組織 (Mei& Ding,1999)。

從分子水平上看，有相同的基因和蛋白參與了文昌魚和脊椎動物的肌肉發(fā)育過程，如堿性肌球蛋白輕鏈和肌動蛋白不僅存在于脊椎動物中, 也同樣存在于文昌魚中 (Holland, 1995; Kusakabe, 1997)。MyoD、Myf5、肌細胞生成素 (myogenin) 和MRF4是控制脊椎動物肌肉細胞決定和分化的關鍵因子(Braun et al, 1989; Davis et al, 1987; Simon &Konieczny, 1989; Wright et al, 1989; Yun, 1996), 能激活一系列肌肉專一因子的表達, 從而促使細胞向肌細胞方向分化。作為一種最接近脊椎動物的頭索動物, 文昌魚在其基因組中有兩個生肌bHLH基因片段 (Araki, 1994, 1996; Beach, 1999; Meedel,1997)。對兩個文昌魚 MyoD基因家族基因AmphiMRF1和AmphiMRF2進行轉錄表達研究發(fā)現兩者最初均在近軸中胚層中表達, 其中AmphiMRF1的表達時間比AmphiMRF2稍晚(Schubert et al, 2003)。

脊索是脊椎動物門胚胎的一個中軸性結構。在較高等的脊椎動物中, 脊索是一個瞬時存在的結構,它定位于胚胎的中間, 與背腹軸與左右的軸極性形成相關。脊索產生一些分泌因子, 給其周圍的組織以信號, 提供其定位和命運分化的信息 (Christ et al, 2004; Danos & Yost, 1995; Fouquet et al, 1997;Goldstein & Fishman, 1998; Lohr et al, 1997;Munsterberg & Lassar, 1995; Pourquié et al, 1993;Yamada et al, 1991, 1993)。作為一個組織, 脊索和軟骨的結構很接近, 看起來近似軟骨的原始形式。因此, 脊索一直支撐胚胎結構直至其他組織的形成；而在一些脊椎動物的進化分支上,比如無顎類脊椎動物 (七鰓鰻)、遠古魚類 (sturgeon鱘魚) 等, 脊索在一生中都存在。在較高等脊椎動物中, 脊索在椎骨中骨化, 對椎骨之間的集中起作用, 存在于稱之為nucleus pulposis的結構中。

肌肉的收縮是通過細胞內 Ca離子濃度來調節(jié)的。在脊椎動物中的調節(jié)機制，肌肉的收縮是通過細胞內 Ca離子濃度來調節(jié)的。在脊椎動物中的調節(jié)機制是可以分為actin調節(jié)和myosin調節(jié)的。條紋肌的收縮主要是通過 actin調節(jié), 而平滑肌的收縮主要是通過myosin調節(jié)。Tropomyosin的作用是調節(jié)actin－myosin的相互作用并且使actin的結構得到穩(wěn)定，但其潛在的生化機制并不是很清楚。

現在發(fā)現在心肌肌肉的發(fā)育與功能的行使中,Tropomyosin也起著很重要的作用 (Steven et al,2003)。心肌細胞的激活狀態(tài)中, Tropomyosin起著重要的作用。在人類條紋肌中發(fā)現的主要的tropomyosin 蛋 白 形 式 是 α-Tropomyosin, β-Tropomyosin和α-慢肌 Tropomyosin 。在小鼠模型中, α-形式過表達到大概整個 Tropomyosin 50%的水平時, 會引起心率加快和對于 Ca離子敏感度的降低 (Pieples et al, 2002)。然而，Tropomyosin的各種異構形式在心肌以及肌肉、脊索中的具體機制仍然不清楚, 需要進一步研究確認。

為了適應真核細胞內與肌動蛋白細肌絲相關的多種功能, Tropomyosin存在有大量的異構體，其中20余種已被確認。這些Tropomyosin異構體分別由可變的啟動子和 RNA序列所表達, 具有共同的結構形式。許多同源體在分布上具有組織和肌絲特異性, 意味著被表達的外顯子和其代表的分子區(qū)域對其相關肌絲的功能具有重要意義。這些基因的突變將引發(fā)各種肌病, 因此，Tropomyosin的分子生物學研究具有重要的臨床意義。

在文昌魚中, 除了文昌魚基因組測序信息之外,目前尚無關于Tropomyosin的報道。鑒于文昌魚的特殊進化地位, 本研究對青島文昌魚tropomyosin基因演譯的蛋白序列進行相似性、同源性和進化分析,并對該基因在胚胎發(fā)育不同時期和成體的部分組織的表達進行系統(tǒng)分析，為進一步研究文昌魚體節(jié)肌肉的形成和脊索的功能奠定了一定的基礎。通過本研究,我們可以確定文昌魚tropomyosin基因在文昌魚胚胎發(fā)育中可能的功能, 這將有助于闡明文昌魚胚胎發(fā)育的分子機制和肌肉分化的相關機制, 并對心肌的發(fā)育與功能以及進化的研究提供資料。

1 材料和方法

1.1 文昌魚的采集及胚胎的收集

中國青島文昌魚 (Branchiostoma japonicum)性成熟個體采集于青島附近沙子口海域和北海海域。實驗室內人工養(yǎng)殖, 自然排精排卵并受精,胚胎置于過濾海水中, 25℃正常發(fā)育。按照不同的發(fā)育時期,取其胚胎及幼蟲, 一部分用 4%多聚甲醛(4%多聚甲醛, 用0.1 mol/L的 MOPS(pH7.5)配制, 含1 mmol/L EGTA, 0.5 mol/L NaCI)室溫固定l h或4 ℃過夜固定后, 梯度酒精脫水至70% (DEPC水配制),?20 ℃保存；另一部分離心收集后迅速加入裂解液裂解, 提取RNA備用。RNA可用于建庫或反轉錄為cDNA作為基因克隆模板。

1.2 RT–PCR擴增文昌魚tropomyosin片段

設計了擴增文昌魚tropomyosin基因的引物。P1：5'-CGATTCCGTGATTGACTC-3'; P2：5'-TCCT TGCTCTCTCGCTCT-3'。通過 RT-PCR的方法得到陽性片段, 插入克隆質粒, 篩選出陽性克隆, 由華大公司對質粒進行測序。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories, Inc.)試劑盒說明, 基于測序所得tropomyosin序列設計引物,5'-GCAAGGAAGGTGCTGAGTAACGAGG-3', 用于擴增該基因的3'末端, 隨后進行PCR擴增, 將獲得的序列連入 pGEM-T-Vector(Promega)并測序, 最后用Contig軟件進行序列拼接得到完整的3'末端, 得到tropomyosin基因的全長序列。

1.3 序列相似性比較及系統(tǒng)進化學分析

以文昌魚tropomyosin基因推測的氨基酸全序列構建進化樹, 利用在線分析工具NCBI-blastx，從NCBI的 GenBank中檢索獲得各個物種的tropomyosin同源序列, 利用Clustalx 1.8軟件對這些序列進行比對及序列相似性分析。用Tree-puzzle 5.2以最大似然法(Maximum likelihood, ML)構建系統(tǒng)進化樹, 并利用 TreeView (Win32)軟件顯示構建好的進化樹。

1.4 文昌魚胚胎和幼體的原位雜交和成體的切片原位雜交

用本實驗室已報道的方法標記正義和反義探針(Liang et al, 2004)。探針長度大約在700 bp～1 kb之間。選擇固定的文昌魚胚胎和幼體, 每個時期40個, 未孵出的胚胎預先剝去受精膜。根據(Zhang &Mao, 2009)所采用的辦法, 以獲得的中國文昌魚tropomyosin片段為模板合成探針, 用正義探針雜交結果作為實驗對照。對文昌魚早期發(fā)育各時期的胚胎和幼體進行原位雜交、常規(guī)石蠟切片, 曙紅復染,光鏡觀察照相。

2 結果與分析

2.1 文昌魚tropomyosin基因的克隆

利用設計的1對引物, 經RT-PCR擴增后得到1段520 bp含有5'開放閱讀框的序列。根據獲得的序列設計引物, 通過3'RACE擴增得到該基因的3'端,經過拼接, 得到文昌魚tropomyosin的完整開放閱讀框的cDNA核苷酸序列, 全長1 210 bp。此閱讀框在 81位核苷酸處有一起始密碼子 ATG, 位于典型的kozak結構中 (Kozak,1986), 在932位核苷酸處有一終止密碼子TAA, 編碼一個284個氨基酸殘基組成的蛋白質。通過與ncbi的Genbank中的數據進行比對, 發(fā)現我們克隆得到的序列與基因組整體測序所得到的白氏文昌魚的tropomyosin基因的序列(GenBank登錄號 GI:8439520) (Suzuki & Satoh,2000)相同。

2.2 文昌魚tropomyosin系統(tǒng)進化的分析

推測得到的 Tropomyosin蛋白與其他物種的Tropomyosin蛋白之間均存在一定的同源性 (圖1)。與佛羅里達文昌魚Tropomyosin氨基酸的一致性最高為 92%; 與爪蛙 (Xenopus laevis) 和墨西哥鈍口螈 (Ambystoma mexicanum) Tropomyosin氨基酸的一致性為70%; 與旋毛形線蟲 (Trichinella spiralis)的一致性是 58%, 與其他脊椎動物斑馬魚 (Danio rerio)、雞 (Gallus、gallus)、小鼠 (Mus musculus) 和人 (Homo sapiens) 氨基酸的一致性分別為 68%、68%、69%和69%。

同源蛋白比對結果見圖 1, 圖中的除白色區(qū)均是高保守區(qū), 這些區(qū)域恰好和 Tropomyosin蛋白結構域重合, 由此可以看到 Tropomyosin蛋白在功能域的進化上是高度保守的。從進化樹中可見,Tropomyosin的進化規(guī)律符合動物分類學中各物種的進化地位 (圖 2)。青島文昌魚和烏賊 (Sepia esculenta)以及旋毛形線蟲 (Trichinella spiralis) 在進化上非常接近, 并且目前的研究表明均只有一個拷貝, 它們很可能歧化于脊椎動物基因出現基因倍增之前。

2.3 文昌魚tropomyosin基因的表達模式分析

圖1 文昌魚 Tropomyosin的同源性比較Fig. 1 Sequence alignment analysis of amphioxus Tropomyosin

圖2 文昌魚Tropomyosin蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the Tropomyosin

用原位雜交(in situhybridization, ISH)的方法,檢測tropomyosin在各胚胎發(fā)育時期以及成體中的表達特異性,結果見圖3。在卵裂期和囊胚期均未發(fā)現文昌魚tropomyosin表達, 在原腸胚晚期神經胚早期開始表達, 轉錄產物存在于內中胚層, 隨著早期胚胎的發(fā)育, 可以在近軸中胚層中觀察到tropomyosin較強的表達。從文昌魚胚胎的背面觀可以看到在身體的前后軸中線的兩側發(fā)育中的肌節(jié)和體節(jié)中有著強表達。由于左右體節(jié)和肌節(jié)的不對稱(Conklin, 1932), 使表達區(qū)域從背面看起來也是不對稱的。隨著發(fā)育的進行轉錄產物逐漸向后延伸,但是在已形成的肌節(jié)中仍然保持表達。從縱切面上可以看到, 肌節(jié)的著色主要位于肌節(jié)之間的分隔處。在神經外胚層和神經管中并未發(fā)現tropomyosin轉錄產物的表達。48 h的幼蟲中也能檢測到tropomyosin在尾芽中的表達, 同時該基因也仍然在已經形成和正在發(fā)育過程中的肌節(jié)和體節(jié)中表達。幼蟲期的文昌魚中檢測到了tropomyosin在已形成肌節(jié)中的表達。胚胎切片顯示,tropomyosin在肌節(jié)和脊索中均有表達。成體切片原位雜交表明,tropomyosin在脊索和神經索中仍然有表達, 并且在肌肉的間隔中有微弱表達, 同時我們發(fā)現, 在腮區(qū)的腮瓣處tropomyosin有較強表達。

3 討 論

圖3 文昌魚不同發(fā)育時期tropomyosin的整封原位雜交、切片原位雜交及其組織學切片Fig. 3 Tropomyosin expression in amphioxus embryos, larvae and adults detected by whole mount in situ hybridization followed by sectioning

文昌魚tropomyosin基因編碼氨基酸序列與其他物種的同源分子一致性非常高, 不論是與較低等的無脊椎動物果蠅或者海膽, 還是與脊椎動物比較,其一致性都在 64%以上, 即使是與人類的tropomyosin其一致性也達到了69%。另外, 文昌魚tropomyosin序列還包含有一個Tropomyosin的結構域,該結構域是Tropomyosin蛋白序列特有的。在該結構域內氨基酸的一致性更高。序列的一致性及其保守結構域的存在說明該基因的功能在進化過程中非常保守, 承擔著比較大的進化壓力。另外, 進化樹顯示文昌魚Tropomyosin與其脊椎動物同源蛋白不屬于同一姐妹群, 其分支位于脊椎動物分支的基部, 這與文昌魚的進化地位一致, 即文昌魚是無脊椎動物向脊椎動物過渡的頭索動物類型。同時也為文昌魚Tropomyosin歧化于脊椎動物出現基因大規(guī)模倍增之前這一理論提供了新的論據。

在海鞘這樣的脊索動物中, 脊索存在于胚胎期和可以自由游泳的幼蟲期, 提供了運動所需要的軸向支持 (Satoh, 2003)。與其類似, 在頭索動物中脊索對于運動也是必須的, 而且存在于整個生命時期(Holland et al, 2004)。在脊索cDNA文庫里面的EST序列分析發(fā)現, 有11%的mRNA是肌肉相關基因。文昌魚成體脊索里面充滿了肌絲來維持它的功能,而肌絲的功能是由肌肉相關基因的活化表達維持的。現在的研究表明, 大概一般以上的文昌魚肌肉相關基因都在文昌魚的脊索細胞中表達, 這些肌肉相關基因也都是脊椎動物肌肉收縮的相關基因。Tropomyosin是肌肉收縮過程中重要的調節(jié)蛋白質，其最重要的特性是能與肌動蛋白相結合,使肌動蛋白穩(wěn)定于聚合狀態(tài),影響并調控肌動蛋白之間的相互作用,從而在調節(jié)細胞能動性、細胞質移動和誘導內皮細胞凋亡等方面起著重要作用。文昌魚Tropomyosin在發(fā)育的胚胎中集中在肌節(jié)和脊索處,胚胎時期的時空表達模式證實了文昌魚胚胎發(fā)育時期的脊索的形成以及肌節(jié)與肌肉的發(fā)生中tropomyosin起著重要的作用, 但是到了成體, 在神經管細胞和脊索處仍然可以檢測到表達的明顯存在。這一現象證明文昌魚成體中Tropomyosin可能和神經纖維的收縮有著密切的關系。Tropomyosin在細肌絲中與肌動蛋白(actin)雙螺旋并行存在,可影響并調控肌動球蛋白之間的相互作用, 調節(jié)肌肉收縮過程。在成體肌節(jié)中和脊索中tropomyosin的同時表達, 而在肌間隔中的表達相對比較微弱, 我們推測文昌魚肌肉的收縮能力并不是很強, 脊索和肌節(jié)可能同時參與文昌魚的個體運動。

我們在文昌魚成體腮區(qū)的腮瓣處檢測到了tropomyosin較強的表達, Huang(2007)對文昌魚的系統(tǒng)解剖學研究發(fā)現, 文昌魚的腮中含有大量的淋巴樣細胞, 且這些細胞在感染后體積增大。進一步對文昌魚進行比較基因組學研究發(fā)現，一些與淋巴細胞發(fā)育和分化密切相關的基因, 這些基因在文昌魚被感染后表達明顯上調, 原位雜交結果顯示，這些基因的表達部位主要位于鰓。這說明原始的適應性免疫可能起源于文昌魚。同時, 有證據提出在文昌魚免疫防御過程中, 其表皮、腮和腸道上皮可能起重要作用(Lin et al, 2011)。而tropomyosin在成體的腮裂處有較強的表達, 但是在無脊椎動物中,Tropomyosin有著一定的免疫原性, 而其在脊椎動物中并不存在免疫原性, Tropomyosin的作用在從無脊椎動物到脊椎動物的進化過程中是如何演變的, 在文昌魚中 Tropomyosin是否只參與腮裂處的纖毛擺動還是也在免疫防御過程中起作用, 仍需進一步研究驗證, 對于其表達調控的機制也有待深入。

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Phylogenetic analysis and expression patterns oftropomyosinin amphioxus

LI Xin-Yi1,2,*, LIN Yu-Shuang2, ZHANG Hong-Wei2

(1.Life Science College,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China; 2.Life Science College,Shandong University,Ji'nan250100,China)

In amphioxus, we found a mesoderm related gene,tropomyosin, which encodes a protein comprising 284 amino acid residues, sharing high identities with other known Tropomyosin proteins both in vertebrates and invertebrates.Phylogenetically, amphioxus Tropomyosin fell outside the invertebrate clade and was at the base of the vertebrate protein family clade, indicating that it may represent an independent branch. From the early neurula to the larva stage,whole-mount in situ hybridization and histological sections found transcripts of amphioxustropomyosingene. Weak tropomyosin expression was first detected in the wall of the archenteron at about 10 hours-post-fertilization neurula stage,while intense expression was revealed in the differentiating presumptive notochord and the muscle. Transcripts oftropomyosinwere then expressed in the formed notochord and somites. Gene expression seemed to continue in these developing organs throughout the neurular stages and remained till 72-hours, during the early larval stages. In situ study still showedtropomyosinwas also expressed in the neural tube, hepatic diverticulum, notochord and the spaces between myotomes in adult amphioxus. Our results indicated thattropomyosinmay play an important role in both embryonic development and adult life.

Amphioxus; Phylogenetic analysis; Embryogenesis; Expression pattern; Tropomyosin

Q959.287; Q344.13; Q951

A

0254-5853-(2012)04-0389-06

10.3724/SP.J.1141.2012.04389

2012-01-06；接受日期：2012-06-13

國家自然科學基金資助項目(30700434)

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: lixinyi@snnu.edu.cn