用HPLC法測定黃麥合劑中淫羊藿苷含量的不確定度分析

孫 黎，蘇克劍，金冠欽（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院藥劑科，上海200001）

不確定度分析是判定測量結(jié)果可信度的依據(jù)，有助于評定各種不確定度來源對實驗結(jié)果的影響，對藥物分析檢測具有重要意義。測量不確定度是由于測量誤差的存在而造成的對被測量值不能確定的程度，是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果有關(guān)聯(lián)的參數(shù)。作者根據(jù)國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準發(fā)布的JJF1059－1999計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》與《測量不確定度評定與表示指南》［1］，以及有關(guān)參考文獻，對HPLC法測定黃麥合劑中淫羊藿苷含量的不確定度進行了評估，現(xiàn)報道如下。

1 材 料

1.1 儀器 Waters 1525型HPLC儀、Waters 2487紫外檢測器、Waters breeze色譜工作站（美國Waters公司）；Mettler AE 240電子天平（Mettler－Toledo公司）；5ml移液管，10ml、100ml容量瓶（上海申立玻璃儀器銷售有限公司），經(jīng)檢定均為A級。

1.2 藥材和試劑 淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號121032－200501）；黃麥合劑（200ml／支，上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號20101101）；乙腈、乙酸（色譜純，美國Merck公司）；乙酸乙酯（分析純，江蘇省蘇州市振亞化工廠，批號20110124）；無水碳酸鈉（江蘇省太倉市美達試劑有限公司，批號20101209）；冰乙酸和甲醇均為色譜純，由美國Tedia公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil－C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：乙腈∶水∶冰乙酸（30∶70∶1）；流速：1ml／min；檢測波長：270nm；柱溫：30℃；進樣量：20μl［2］。

2.2 溶液的配制 （1）對照品溶液：精密稱取1.0mg淫羊藿苷對照品，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.1mg／ml的對照品溶液。（2）供試品溶液：取批號為20101101的黃麥合劑20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，乙酸乙酯用量第一次60ml，第二次和第三次均為40ml，合并乙酸乙酯層。取25ml的5%碳酸鈉溶液洗滌兩次，取乙酸乙酯層，在90℃水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10ml，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 標準曲線的制備 取適量0.1mg／ml的淫羊藿苷對照品溶液，倍比稀釋，得到系列濃度為3.125、6.250、12.50、25.00和100.0μg／ml的淫羊藿苷對照品溶液，各取20μl，按2.1項下色譜條件測定峰面積。以淫羊藿苷的峰面積（A）對濃度（c）進行線性回歸，得到標準曲線方程：A＝1.832× 10－5c＋0.812（r＝0.999 9），表明淫羊藿苷在3.125～100μg／ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 精密吸取2.2項下濃度為0.1mg／ml的對照品溶液20μl，連續(xù)進樣6次，結(jié)果測得淫羊藿苷峰面積的RSD為2.45%（n＝6）。2.4.2 重復(fù)性實驗 取2.2（2）項下方法配制的黃麥合劑供試品溶液6份，測定淫羊藿苷峰面積，計算得到RSD＝1.13%（n＝6）。

2.4.3 加樣回收率實驗 用移液管精密吸取淫羊藿苷含量已知的黃麥合劑20ml置100ml容量瓶中，分別加入低、中、高3個濃度（9.299、10.299、11.299mg／ml）的淫羊藿苷對照品溶液適量，每個濃度制備3個樣品，按2.2項下方法（2）配制得到混合供試品溶液，測定淫羊藿苷的含量并計算回收率。結(jié)果低、中、高濃度的淫羊藿苷回收率分別為90.33%、92.54%和95.09%（n＝3），平均回收率為（92.65±2.38）%（n＝9），符合測定方法學(xué)要求。

圖1 不確定度分量因果圖Figure 1 Causality diagram of uncertainty components

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 取2.2（2）項下方法配制的黃麥合劑供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8h進樣測定淫羊藿苷的峰面積，計算得到RSD＝2.45%（n＝5），表明供試品溶液在配制后8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品含量測定 精密量取黃麥合劑樣品（批號20101101）20ml，按2.2項下方法（2）制備供試品溶液，連續(xù)進樣3次，測得其中淫羊藿苷的含量分別為5.350、5.233和5.315μg／ml，均值±標準差為（5.299±0.060）μg／ml（n＝3）。

2.6 不確定度分析 根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF1059－1999）［1］，以對照品溶液配制（Cr）、樣品制備（Cs）、重復(fù)性（R）、擬合回歸模型（L）［3］和其他影響因素（F），作為影響HPLC法測定黃麥合劑中淫羊藿苷含量的不確定度的主要因素。根據(jù)實驗步驟、方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)、影響結(jié)果的因素等，對各不確定分量分別進行計算，流程詳見圖1。

2.6.5 其他影響因素（F）引入的不確定度 由于本實驗室的環(huán)境處于正常質(zhì)量控制程序中，溫度和濕度波動較小，所以環(huán)境溫度和濕度的變化對稱量和儀器設(shè)備穩(wěn)定性帶來的不確定度可忽略不計。

2.6.7 擴展不確定度 測定結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，選擇包含因子k＝2，得到u＝k× urel＝2×0.019 3＝0.038 6μg／ml。因此HPLC法測得黃麥合劑中淫羊藿苷的含量為（5.299± 0.039）μg／ml，k＝2。

3 討 論

不確定度測量的重要性已得到了廣泛的認可，將不確定度測定方法應(yīng)用于中藥材有效成分的定量分析，有助于推動中藥標準化的發(fā)展。本研究以HPLC法測定黃麥合劑中淫羊藿苷的含量，探討了此方法不確定度的評定步驟。由計算結(jié)果可以看出，檢測過程中對不確定度影響最大者是來自于重復(fù)性引入的不確定度，其值由精密度測定的不確定度表示，與樣品提取步驟較多有密切關(guān)系。由此提示研究者在含量測定過程中，需要考慮精化樣品提取方法，以提高測定結(jié)果的準確性。

［1］ 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計量司組.測量不確定度評定與表示指南［M］.北京：中國計量出版社，2000：1－3.

Measure Department of State Quality and Technology Supervision Bureau.Guide to the evaluation and expression of uncertainty in measurement［M］.Beijing：China Metrology Press，2000：1－3.In Chinese.

［2］ 馬秀建.RP－HPLC法測定氣血雙生合劑中淫羊藿苷、蛇床子素、五味子甲素與五味子乙素的含量［J］.藥學(xué)與臨床研究，2009，17（2）：112－114.

Ma XiuJian.Determination of icariin，osthole，deoxyschizan－drin，γ－schizandrin in Qixueshuangsheng mixtures by RP－HPLC［J］.Pharm Clin Res，2009，17（2）：112－114.In Chinese with English abstract.

［3］ 張忠華，陳 玟，許美娟，等.LC－MS／MS法測定人血漿中石杉堿甲濃度的不確定度分析［J］.中國藥房，2011，22（38）：3582－3585.

Zhang ZhongHua，Chen Min，Xu MeiJuan，et al.Analysis of uncertainty measurement of huperzine A content in human plasma by LC－MS／MS［J］.China Pharmacy，2011，22（38）：3582－3585.In Chinese with English abstract.