用HPLC法同時測定感冒安顆粒中沒食子酸、綠原酸及咖啡酸的含量

陳方劍，宋洪杰，高鴻彬，王志君，傅 芃，陸松偉，袁文琳（第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433）

感冒安顆粒是由金銀花、連翹、拳參、桑葉等七味中藥制成的復(fù)方制劑，具有抗病毒、抗菌等作用，屬純中藥制劑，在臨床上使用多年，主治感冒發(fā)熱、畏寒、頭痛、咽喉腫痛等及由感冒所致上呼吸道感染、急性扁桃體炎、急性咽喉炎等，療效十分顯著。至今未發(fā)現(xiàn)與本制劑相關(guān)的不良反應(yīng)，安全性好。但其有效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，有必要對其有效成分進行深入研究。作者采用正交設(shè)計優(yōu)化感冒安顆粒中總酚酸的提取工藝，研究結(jié)果表明，該制劑中約含有11mg／g酚酸類化合物。酚酸具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等藥理作用［1］。該制劑中金銀花、桑葉、拳參、連翹和紫蘇等藥材含有大量的酚酸類化合物，如綠原酸、異綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、1，5－二咖啡酰奎寧酸、阿魏酸等［2－7］。本研究以綠原酸、沒食子酸和咖啡酸作為指標(biāo)性成分對感冒安顆粒進行定量，為提高其質(zhì)量標(biāo)準以及進一步優(yōu)化處方工藝提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀（包括LC－20AD泵、SPD－M20A二極管陣列檢測器、CBM－20A控制器和LC solution工作站，日本島津公司），XS205DU電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司），DL－720A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）等。

1.2 藥品和試劑 感冒安顆粒（第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號：111025、111121、111130、120207、120214、120314、120327、120328、120329、120330），沒食子酸（純度90.1%，批號110831－200803）、綠原酸（批號110753－200413）和咖啡酸對照品（批號110885－200102）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A相）－0.4%磷酸溶液（B相），梯度洗脫：0～7.50min A相2%，7.50～7.51min A相2%→12%，7.51～25.00min A相12%；流速：0.8ml／min；柱溫：室溫；檢測波長：沒食子酸272nm、綠原酸和咖啡酸327nm；進樣量：20μl。

2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液 取在120℃干燥至恒重的沒食子酸、綠原酸和咖啡酸對照品，分別精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇適量，超聲使溶解，放冷，定容至刻度，搖勻，分別配制成每1ml中含沒食子酸108.0μg、綠原酸100.0μg和咖啡酸120.0μg的對照品溶液，備用。（2）供試品溶液 取感冒安顆粒0.5g，精密稱定，置50ml量瓶中，加50%甲醇35ml，超聲提取30min，放冷，過濾，濾液加50%甲醇溶液定容至50ml，搖勻。用0.45μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液0.5ml，加等量流動相稀釋后混勻，即得供試品溶液。（3）陰性對照溶液 按處方比例稱取除金銀花、桑葉、拳參、連翹和紫蘇外的各種藥材適量，依照處方工藝及供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗 按照2.1項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20μl進樣測定。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相同的保留時間上有相同的色譜峰，而陰性對照品在此處則無吸收峰，表明專屬性良好，結(jié)果見圖1。

圖1 感冒安顆粒的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of Ganmao’an granules

2.4 標(biāo)準曲線的制備 分別精密量取2.2（1）項下的沒食子酸、綠原酸和咖啡酸對照品溶液置于10ml棕色量瓶中，加流動相稀釋，定容至刻度，混勻，使沒食子酸的含量為0.27、0.54、1.08、2.16、4.32、8.64μg／ml，綠原酸含量為1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00μg／ml，咖啡酸含量為0.30、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60μg／ml。按2.1項下色譜條件進樣20μl，測定峰面積（Y），以樣品濃度（X）進行線性回歸，計算回歸方程。沒食子酸：Y＝97 925 X－6 716.3，r＝0.999 9；綠原酸：Y＝83 908 X－ 19 783，r＝0.999 7；咖啡酸：Y＝187 005 X－15 809，r＝0.999 8。結(jié)果表明，沒食子酸在0.27～8.64μg／ml、綠原酸在1.00～32.00μg／ml、咖啡酸在0.30～9.60μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗 精密吸取對照品混合溶液20μl，按2.1項下色譜條件重復(fù)進樣5次，按峰面積計算沒食子酸、綠原酸和咖啡酸的日內(nèi)RSD分別為0.62%、0.63%和0.62%（n＝5）。精密吸取對照品混合溶液20μl，每天測定1次，連續(xù)測定5d，記錄峰面積，計算得到?jīng)]食子酸、綠原酸和咖啡酸的日間RSD分別為0.81%、0.67%和0.72%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 按2.2（2）項下供試品溶液制備方法制備感冒安顆粒供試品溶液（批號120207），分別在0、2、4、6、8h各進樣1次，記錄峰面積，計算得到?jīng)]食子酸、綠原酸和咖啡酸的RSD分別為1.26%、0.91%和0.93%（n＝5），表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 按2.2（2）項下供試品溶液制備方法制備5份感冒安顆粒供試品溶液（批號120207），按2.1項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得到?jīng)]食子酸、綠原酸和咖啡酸的RSD分別為0.34%、1.86%和0.61%（n＝5），表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實驗 取同一批號已知沒食子酸、綠原酸和咖啡酸含量的感冒安顆粒（批號120207，沒食子酸含量約0.050mg／0.5g，綠原酸含量約0.710mg／0.5g，咖啡酸含量約0.054mg／0.5g）9份，每份約0.5g，精密稱定，各加入沒食子酸（0.051mg／ml）、綠原酸（0.650mg／ml）和咖啡酸（0.054mg／ml）對照品溶液1ml，分別按照2.2（2）項下方法制備供試品溶液并測定含量，計算樣品的加樣回收率。結(jié)果平均回收率分別為沒食子酸100.14%，RSD＝1.66%（n＝9）；綠原酸98.10%，RSD＝2.38%（n＝9）；咖啡酸100.48%，RSD＝2.28%（n＝9）。

2.9 樣品含量測定 取10個批號的感冒安顆粒，按2.2（2）項下方法制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表1。

表1 感冒安顆粒中沒食子酸、綠原酸和咖啡酸含量測定結(jié)果Table 1 Results of content determination of gallic acid，chlorogenic acid and caffeic acid in Ganmao’an granules（n＝3，±s）

表1 感冒安顆粒中沒食子酸、綠原酸和咖啡酸含量測定結(jié)果Table 1 Results of content determination of gallic acid，chlorogenic acid and caffeic acid in Ganmao’an granules（n＝3，±s）

批號沒食子酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）綠原酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）咖啡酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）111025 0.144±0.002 1.39 1.081±0.003 0.28 0.133±0.003 2.26 111121 0.122±0.002 1.64 1.271±0.011 0.87 0.115±0.003 2.61 111130 0.115±0.003 2.61 1.275±0.007 0.55 0.115±0.002 1.74 120207 0.099±0.001 1.01 1.421±0.012 0.84 0.108±0.002 1.85 120214 0.124±0.002 1.61 1.474±0.015 1.02 0.130±0.001 0.77 120314 0.114±0.002 1.75 0.980±0.013 1.33 0.117±0.003 2.56 120327 0.126±0.001 0.80 0.947±0.026 2.75 0.126±0.002 1.59 120328 0.122±0.003 2.46 0.964±0.012 1.24 0.132±0.002 1.52 120329 0.127±0.002 1.57 1.009±0.002 0.20 0.127±0.002 1.57 120330 0.127±0.001 0.80 0.983±0.021 2.14 0.121±0.001 0.83

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇 參考相關(guān)文獻［8，9］及檢測器的紫外掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在272nm處有最大吸收，而綠原酸和咖啡酸在327nm處有最大吸收。為了確保檢測靈敏度和準確性，本研究采用二極管陣列檢測器，達到在兩個波長處對3種酚酸類成分同時分別定量的目的。

3.2 流動相的選擇 本研究曾用乙腈－0.4%磷酸（10∶90）、（5∶95）、（3.5∶96.5）和（3.3∶96.7）為流動相進行洗脫，樣品中的其他峰未能與被測組分中的沒食子酸很好地分離；最后選用本研究的流動相梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)各峰分離度較好，且出峰時間適中。

3.3 結(jié)果分析 含量測定結(jié)果顯示，不同批號的感冒安顆粒中沒食子酸、綠原酸和咖啡酸的含量存在一定差異。不同批次的藥材由于其產(chǎn)地、采收期的不同和干燥、加工炮制及儲存過程中活性成分流失等可能會導(dǎo)致其含量不同；制劑儲存時間的長短也有可能造成其含量的差異。由于本研究僅隨機抽取10個批號的感冒安顆粒樣品，因此對其中沒食子酸、綠原酸和咖啡酸含量范圍的確定還需要進一步研究。

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