原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織中間隙連接蛋白32和43的表達(dá)及其臨床意義

夏照明,朱陳輝,萬克松,胡衛(wèi)列△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,廣州 510515;2.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科 510010)

原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織中間隙連接蛋白32和43的表達(dá)及其臨床意義

夏照明1,朱陳輝2,萬克松2,胡衛(wèi)列2△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,廣州 510515;2.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科 510010)

目的研究間隙連接蛋白(Cx)32和43在原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的表達(dá),探討其在原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤的臨床診斷及預(yù)后評估中的價值?方法 應(yīng)用免疫組化NovolinkTMPolymer法檢測21份正常腎上腺組織?45份腎上腺皮質(zhì)腺瘤及14份腎上腺皮質(zhì)癌標(biāo)本中Cx32?Cx43的表達(dá)水平,運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理?結(jié)果Cx32和Cx43在腎上腺皮質(zhì)癌中表達(dá)陽性率分別為21.4%和35.7%,明顯低于腎上腺皮質(zhì)腺瘤中的68.9%和75.6%(P=0.002,P=0.010)及正常腎上腺組織中的85.7%和100%(P=0.000,P=0.000);腎上腺皮質(zhì)腺瘤中Cx43表達(dá)的陽性率低于正常腎上腺組(P=0.013)?Cx43的表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)腺癌患者的預(yù)后相關(guān)(P0.05),Cx43表達(dá)越低患者預(yù)后越差?在腎上腺皮質(zhì)癌中,Cx32和Cx43之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P=0.015)?結(jié)論聯(lián)合檢測Cx32和Cx43的表達(dá)對鑒別良?惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤具有重要的參考意義?Cx43在原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)癌組織的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān),增加其表達(dá)可能改善患者預(yù)后?

腎上腺皮質(zhì)腺瘤;腎上腺皮質(zhì)癌;連接蛋白類

脊椎動物的間隙連接(gap junction,GJ)是由不同的間隙連接蛋白(connexin,Cx)構(gòu)成的細(xì)胞連接通道?目前為止,在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的Cx已達(dá)21種,其介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)可在細(xì)胞間傳遞生物信號和能量,從而調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝?增殖和分化,對維持機(jī)體的正常功能具有重要作用,近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),Cx表達(dá)水平的下降?喪失及異位表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生?發(fā)展密切相關(guān),而通過轉(zhuǎn)染使Cx基因正常表達(dá)可以抑制腫瘤的生長?侵襲及轉(zhuǎn)移?已知Cx32和Cx43在正常腎上腺中均有表達(dá),但Cx32和Cx43在原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤方面的研究,國內(nèi)外少有報道?本研究通過觀察Cx32和Cx43在正常腎上腺組織?腎上腺皮質(zhì)腺瘤和腎上腺皮質(zhì)癌組織中的表達(dá),探討間隙連接蛋白Cx32和Cx43與原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)生?發(fā)展的關(guān)系及其臨床應(yīng)用價值?

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集1990年4月至2010年12月在中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院經(jīng)開放或腹腔鏡手術(shù)切除的59例典型的腎上腺腫瘤患者標(biāo)本,患者均有完整的臨床資料和隨訪結(jié)果,術(shù)前均未接受化療及放療?全部腫瘤標(biāo)本經(jīng)病理證實,結(jié)合臨床資料確定其中腎上腺皮質(zhì)腺瘤45例,腎上腺皮質(zhì)癌14例?正常腎上腺組織標(biāo)本21份,為中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科行尸體腎移植取腎源時所取的腎上腺組織,經(jīng)HE染色證實為正常腎上腺組織?所有組織標(biāo)本統(tǒng)一采用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,組織切片厚度為2.5μm?本組病例腎上腺皮質(zhì)腺瘤組中,男19例,女26例;腎上腺皮質(zhì)癌組中,男10例,女4例?腎上腺皮質(zhì)腺瘤患者除手術(shù)治療外,未加化療?放療及其他特殊治療;腎上腺皮質(zhì)癌患者隨訪時間126～2 319d,其中死亡10例(2例死于非腫瘤原因),4例健康存在?

1.2 方法

1.2.1 試劑 Cx32?Cx43多克隆抗體購自北京博奧生物工程有限公司,NovolinkTMPolymer試劑盒購于北京中衫金橋生物工程有限公司,免疫組織化學(xué)采用NovolinkTMPolymer法,Cx32?Cx43稀釋濃度均為1∶300(稀釋劑為一抗稀釋液)?

1.2.2 染色步驟 切片用二甲苯常規(guī)脫蠟,梯度乙醇和蒸餾水水化?0.5%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶10min,自來水沖洗,蒸餾水沖洗,0.01mol/L?pH=6.0的檸檬酸緩沖液進(jìn)行高溫修復(fù)抗原2min,冷水降溫后自然冷卻,PBS沖洗,滴加RE7102抑制內(nèi)源性過氧化物酶5min,PBS沖洗3次(每次5min),滴加一抗4℃ 冰箱內(nèi)孵育過夜,PBS洗3次(每次5min),滴加一抗后封閉劑(RE7111)孵育切片30min,PBS洗3次(每次5min),滴加二抗(NovolinkTM聚合物)孵育切片30min,PBS洗3次(每次5min),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5min,自來水洗,蒸餾水洗,蘇木精復(fù)染2min或不復(fù)染,自來水洗?脫水,透明,封片?以 0.01mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗為陰性對照,分別以已知陽性的正常肝組織?正常腎上腺組織切片作Cx32和Cx43的陽性對照?

1.2.3 結(jié)果判定 分別由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在不知臨床和病理資料的情況下獨立閱片,光鏡下細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞標(biāo)志?Cx32和Cx43表達(dá)結(jié)果的判斷方法一致,即在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個視野,計數(shù)200個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞百分率,陽性細(xì)胞數(shù)小于10%為陰性(-),10%～25%為弱陽性(+),25%～50%為中等陽性(++),≥50%的為強(qiáng)陽性(+++)?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理?率的比較采用四格表的χ2檢驗,各因素間的相關(guān)性用Spearmen等級相關(guān)分析進(jìn)行,生存分析用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行?以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 Cx32?Cx43在各種組織中的表達(dá)結(jié)果 Cx32?Cx43主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá),在正常腎上腺組織中主要表達(dá)于束狀帶及網(wǎng)狀帶,球狀帶較少表達(dá)?Cx32在正常腎上腺組織?腎上腺皮質(zhì)腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌組織中的陽性表達(dá)率分別為85.7%?68.9%?21.4%?Cx43在正常腎上腺組織?腎上腺皮質(zhì)腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌組織中的陽性表達(dá)率分別為100%?75.6%?35.7%?Cx32?Cx43在腎上腺皮質(zhì)癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于腎上腺皮質(zhì)腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?腎上腺皮質(zhì)腺瘤中Cx43的陽性表達(dá)率低于正常腎上腺組織(P0.05),腎上腺皮質(zhì)腺瘤中Cx32的陽性表達(dá)率與正常腎上腺組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?見插Ⅱ圖1?2及表1?

表1 Cx43和Cx32在各種組織中的表達(dá)結(jié)果(n)

2.2 Cx32?Cx43的表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌患者臨床病理的關(guān)系Cx32?Cx 43與腎上腺皮質(zhì)癌患者的年齡?性別?腫瘤的臨床分期無明顯相關(guān)性(P0.05),見表2?

2.3 Cx32?Cx43的表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌患者預(yù)后的關(guān)系 14例腎上腺皮質(zhì)癌患者死亡10例,利用Cox回歸模型進(jìn)行多因素生存分析,Cx32與原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)癌的預(yù)后無關(guān)(P0.05);Cx43與原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)癌的預(yù)后有相關(guān)性(P0.05),Cx43表達(dá)越低,患者預(yù)后越差?

表2 Cx43和Cx32表達(dá)結(jié)果與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 腎上腺皮質(zhì)癌中Cx32?Cx43表達(dá)的關(guān)系 11例Cx32陰性的腎上腺皮質(zhì)癌中有9例Cx43呈陰性,5例Cx43陽性的腎上腺皮質(zhì)癌中3例Cx32呈陽性?單因素相關(guān)分析結(jié)果表明,Cx32和Cx43之間的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.646,P=0.013)?

3 討 論

腎上腺皮質(zhì)癌是一種比較罕見的腎上腺惡性腫瘤,年發(fā)病率為1～2/100萬,40%的患者在診斷時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,從影像學(xué)上難以診斷,腎上腺皮質(zhì)癌的組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)和腎上腺皮質(zhì)腺瘤皮質(zhì)相像,從病理形態(tài)及臨床表現(xiàn)鑒別腎上腺皮質(zhì)腫瘤的良?惡性亦比較困難,因此非常有必要從蛋白水平上對腎上腺皮質(zhì)腫瘤進(jìn)行研究,探討其生物學(xué)行為,為臨床診斷及治療提供理論依據(jù)?

GJ普遍存在于脊椎動物體內(nèi),是細(xì)胞連接的一種,由相鄰細(xì)胞膜上的Cx構(gòu)成?GJIC介導(dǎo)相鄰細(xì)胞電信號的直接傳遞,以及營養(yǎng)物質(zhì)?代謝產(chǎn)物?離子?第二信使?相對分子質(zhì)量小于1000的親水性物質(zhì)的交換[1],GJIC在胚胎發(fā)育?細(xì)胞分化和增殖?內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及細(xì)胞間活動協(xié)調(diào)等方面具有重要作用?研究證實Cx表達(dá)異常與腫瘤的增殖?侵襲?轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[2],范松青等[3]采用組織微陣列與免疫組織化學(xué)染色研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤存在Cx的表達(dá)異常?

人的Cx32基因定位在X染色體Xp11.q22_上,其相對分子質(zhì)量為32×103,主要表達(dá)在正常的肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上,在泌尿系統(tǒng)中也有不同程度表達(dá)?Cx32作為一種抑癌基因在腎癌的發(fā)生?發(fā)展?治療中的作用研究較多[4],而在腎上腺方面的研究主要集中在動物實驗[5],Willenberg等[6]研究發(fā)現(xiàn) Cx32主要表達(dá)于腎上腺皮質(zhì)區(qū),在腎上腺髓質(zhì)及腎上腺髓質(zhì)腫瘤沒有表達(dá)?本研究發(fā)現(xiàn)Cx32在腎上腺皮質(zhì)組織?腎上腺皮質(zhì)腺瘤,腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)的陽性率分別為85.7%?68.9%?21.4%,Cx32在腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)的陽性率明顯低于腎上腺皮質(zhì)腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Cx32與腎上腺皮質(zhì)癌患者的臨床分期?性別?年齡以及預(yù)后均無相關(guān)性(P0.05)?

Cx43是第一個被克隆的Cx,其相對分子質(zhì)量為43×103,人的組織中的Cx43存在兩個基因位點,一個表達(dá)基因定位在6號染色體上,另一個假基因(pseudogene)定位在5號染色體上?Cx43是Cx中研究最多的一種蛋白,Cx43在膀胱移行細(xì)胞癌[7]?非精原細(xì)胞瘤[8]?子宮內(nèi)膜癌[9]?胃癌[10]等 惡性 腫瘤的下調(diào)表達(dá)已有報道?Murry等[11]研究發(fā)現(xiàn)Cx43主要表達(dá)于腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶及束狀帶,在腎上腺髓質(zhì)沒有表達(dá)或微弱表達(dá),Cx43在腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)的陽性率明顯低于腎上腺皮質(zhì)腺瘤及正常腎上腺組織?本研究發(fā)現(xiàn)Cx43在腎上腺皮質(zhì)組織?腎上腺皮質(zhì)腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)的陽性率分別為100%?75.6%?35.7%,Cx43在腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)的陽性率明顯低于腎上腺皮質(zhì)腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);生存分析顯示,Cx43與腎上腺皮質(zhì)癌患者的預(yù)后相關(guān)(P0.05),Cx43表達(dá)的陽性率越低,患者的預(yù)后越差?

大量研究表明,Cx異常表達(dá)和GJIC功能缺陷與多種腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)?近年來,利用基因敲除及負(fù)顯性抑制技術(shù)(dominant negative)阻斷Cx基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞失去對生長的控制,從而形成腫瘤,因此Cx家族基因也被認(rèn)為是腫瘤抑制基因[12]?Cx抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制目前尚不明確,McLanhlan等[13]研究發(fā)現(xiàn)增加 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中Cx26?Cx43的表達(dá)可以抑制腫瘤的發(fā)生?Langlois等[14]研究發(fā)現(xiàn)Cx43抑制腫瘤的發(fā)生與小凹蛋白(caveolin-1)密切相關(guān)?目前研究還發(fā)現(xiàn)Cx的強(qiáng)制表達(dá)可以使得N-粘蛋白表達(dá)下降及增加MDA-MB-43乳腺癌細(xì)胞對凋亡的敏感性,從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[15]?作者推測GJ減少或者喪失使機(jī)體的調(diào)控信息不能有效傳遞到細(xì)胞,細(xì)胞間信號得不到交換,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失平衡,細(xì)胞功能異常等,這一系列變化導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?

本實驗采用免疫組化的方法對腎上腺皮質(zhì)腫瘤中Cx32?Cx43的表達(dá)進(jìn)行初步的研究,并將Cx32?Cx43的表達(dá)與患者臨床資料進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析,研究結(jié)果顯示Cx32?Cx43與腎上腺腫瘤的發(fā)生?發(fā)展有一定的關(guān)系,二者之間呈正相關(guān),其相互作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究?本研究提示臨床中聯(lián)合檢測腎上腺腫瘤組織中Cx32?Cx43的表達(dá)對鑒別腎上腺皮質(zhì)腫瘤的良?惡性有一定的參考價值,檢測腎上腺皮質(zhì)癌中Cx43的表達(dá)對判斷患者的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義?

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Expression and clinical significance of Cx32 and Cx43 in primary adrenal cortical tumors

,,,
(1.,,510515,;2.,,,510010,)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of connexin 32and connexin 43proteins in adrenal tumors.MethodsThe expression of connexin 32and connexin 43in 80specimens including 21cases of normal adrenal gland,45cases of cortex adenoma and 14cases of cortex adenocarcinoma,were detected by NovolinkTMPolymer immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of connexin 32and connexin 43were 21.4% ,35.7%in cortex adenocarcinoma which were significantly lower than 68.9%and 75.6%respectively in cortex adenoma(P=0.002,P=0.010)and it also lower than 85.7%and 100%respectively in normal adrenal gland(P=0.000,P=0.000).The positive rate of connexin 43was 75.6%in cortex adenoma which was significantly lower than 100%in normal adrenal gland(P=0.013).The positive expression of connexin 43was negative correlated with the prognosis of adrenal cortex adenocarcinoma:the lower expression intensity of connexin43,the worse the patients prognosis(P0.05).Incortex adenocarcinoma,the expression of connexin 32was positive correlated with the expression of connexin 43.ConclusionMeasurements of connexin 43and connexin 32may helpful to distinguish malignant from non-malignant tumors.Expression of connexin 43is closely correlated to the prognosis of patients,increasing the expression of connexin 43may improve the patients prognosis.

adrenocortical adenoma;adrenocortical carcinoma;connexins

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.013

A

1671-8348(2012)18-1824-03

△通訊作者,E-mail:Huwl-mr@vip.sina.com?

2012-01-09

2012-05-22)

?臨床研究?