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      血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在血管外膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)研究

      2012-01-26 07:16:56沈頡
      當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2012年24期
      關(guān)鍵詞:外膜平滑肌纖維細(xì)胞

      沈頡

      血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在血管外膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)研究

      沈頡

      目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在血管壁外膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)。方法 采用ELISA方法來檢測(cè)外膜成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌及TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌的影響,使用Western blot法觀察TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF等對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子I型受體表達(dá)的影響。結(jié)果 血管外膜成纖維細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。TGF-β能顯著增高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌(n=5,P<0.05),而PDGF、bFGF、AngⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=5,P>0.05)。TGF-β、PDGF、bFGF、AngⅡ均可刺激外膜成纖維細(xì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子I型受體表達(dá)增高(n=4,P<0.05)。結(jié)論 血管壁外膜成纖維細(xì)胞可以分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,血管局部活性物質(zhì)能有效刺激其受體表達(dá)增高。因此推測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可能介導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞參與血管壁的重構(gòu)。

      血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子I型受體(VEGFR-1);血管外膜成纖維細(xì)胞(AFs)

      血萎內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一類特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)以及促進(jìn)血管形成的生長(zhǎng)因子,其作為一種有絲分裂原需與特異性受體結(jié)合,從而激活一系列的細(xì)胞信號(hào)通路。VEGF主要與2種酪氨酸激酶受體結(jié)合:VEGF 1型受體(vascular endothelial growth factor receptor-1)以及VEGF 2型受體(vascular endothelial growth factor receptor-2)。近期研究表明VEGF及其受體不僅可以在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),在許多非內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá),且在這些非內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓血管改變等許多血管性病變密切相關(guān)[1-3]。

      1996年Shi首次提出外膜重塑(vascular adventitial remodeling)的概念[4],大量文獻(xiàn)證實(shí)血管外膜參與血管壁的重塑過程。文獻(xiàn)證實(shí)TGFβ1能誘導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblasts,AFs)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化參與血管新生內(nèi)膜形成,并發(fā)現(xiàn)血管外膜成纖維細(xì)胞存在VEGFR-1的表達(dá),且在VEGF刺激下,外膜成纖維細(xì)胞遷移活性增強(qiáng)。從而提示VEGF/VEGFR在血管外膜細(xì)胞上的表達(dá)具有功能上的意義[5]。本研究擬采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)的血管外膜成纖維細(xì)胞中VEGF分泌,選取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ與血管局部病理改變密切相關(guān)的刺激因素,觀察其對(duì)AFs細(xì)胞VEGF分泌及VEGFRs表達(dá)的影響,為AFs參與血管重構(gòu)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料 清潔級(jí)SD大鼠,雄性,體重180~200g:上海BK公司;DMEM培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清:GIBCO公司;重組人b-FGF(100-18B),重組人VEGF165(100-20),TGF-β(Cat No: 100-21R):PeproTech EC Ltd;PDGFBB:R&D system;AngⅡ:Sigma公司;BSA:Sigma公司;多克隆兔抗VEGFR-1抗體(sc-316)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、單克隆小鼠抗β-actin:Santa Cruz;VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒:晶美生物工程(北京)有限公司。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定[5]

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)采用組織貼壁方法進(jìn)行血管外膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。具體如下:SD大鼠處死后,開胸取出胸主動(dòng)脈,于DMEM培養(yǎng)基中分離周圍組織后,縱向剪開血管,剝除內(nèi)膜后,分離中膜層和外膜層,將外膜層剪成1mm2大小的組織塊,使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)、傳代,本研究使用的細(xì)胞為第4~6代成纖維細(xì)胞。

      1.2.2 細(xì)胞鑒定 采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。將血管外膜成纖維細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞懸液分別滴種于蓋玻片上,放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至適當(dāng)密度取出,作以下處理:吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗3次,95%乙醇4℃固定10min,PBS漂洗3次,加封閉液室溫下作用20min,去封閉液,加1:100小鼠抗α-SM actin單抗37℃作用2h,PBS漂洗3次,加1:200辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG室溫下孵育1h,PBS漂洗3次,加DAB顯色,顯微鏡下觀察,適時(shí)終止反應(yīng),常規(guī)脫水,透明封片。

      血管外膜成纖維細(xì)胞α-SM actin免疫染色呈陰性,而中膜平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SM actin呈陽(yáng)性。

      1.3 AFs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的分泌

      1.3.1 細(xì)胞分組 將血管外膜成纖維細(xì)胞接種于φ6cm培養(yǎng)皿,予不含血清的DMEM培養(yǎng)液靜止48h后,共分2組:一組予2mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液于普通CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)3、6、12、24、48、72h;另一組分別予2mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液、2mL含10ng/mL TGF-β的DMEM培養(yǎng)液、2mL含10ng/mL bFGF的DMEM培養(yǎng)液、2mL含10ng/mL PDGF的DMEM培養(yǎng)液、2mL含10-7 AngⅡ的DMEM培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;依次收集細(xì)胞的上清液。經(jīng)低溫冷凍機(jī)干燥后用400μl無菌蒸餾水復(fù)溶[6]。

      1.3.2 ELISA檢測(cè) 使用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量。根據(jù)試劑盒說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,取100μl樣品加入已包被抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單抗的酶標(biāo)板上,充分混勻后置37℃溫度下反應(yīng)90min,洗板后加入生物素化的一抗1h,再次洗板后加入酶標(biāo)二抗30min,然后加入酶底物15min,測(cè)定吸光度。計(jì)算樣品中VEGF的含量[7]。

      1.4 Western blot法測(cè)定VEGFR-1表達(dá) 待血管外膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài),予不含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。分別給予空白DMEM(對(duì)照)或含10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7M AngII的DMEM培養(yǎng)基刺激24h。抽提細(xì)胞總蛋白。電泳后轉(zhuǎn)膜,以脫脂奶粉封閉,標(biāo)一抗(VEGFR-1,1:500)4℃過夜,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體,于室溫下振搖約1h,X光壓片曝光后分析[5]。

      2 結(jié)果

      2.1 細(xì)胞鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:α-SM actin在血管平滑肌細(xì)胞呈陽(yáng)性染色(棕黃色),而95%血管外膜成纖維細(xì)胞基本無著色,呈陰性(圖1)。

      圖1 血管外膜成纖維細(xì)胞(上)、中膜平滑肌細(xì)胞(下)α-SM actin免疫組化染色圖(×200)。平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見到α-SM actin表達(dá)的棕黃色陽(yáng)性染色,成纖維細(xì)胞中幾乎無陽(yáng)性染色。

      圖2 血管外膜成纖維細(xì)胞VEGF的分泌。A:細(xì)胞在無血清DMEM中培養(yǎng)0、3、6、12、24、48、72h后細(xì)胞上清液中VEGF分泌。B:細(xì)胞靜止48h后,在空白DMEM中培養(yǎng)24h及10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激24h后細(xì)胞上清液中VEGF分泌。aP<0.05。

      2.2 血管外膜成纖維細(xì)胞分泌VEGF ELISA結(jié)果(圖2):AFs細(xì)胞能夠分泌VEGF。根據(jù)文獻(xiàn)所示,TGF-β、bFGF、PDGF在10ng/mL左右對(duì)成纖維細(xì)胞的作用活性最大,而AngⅡ在10-7左右活性最大[5,8]。TGF-β能顯著刺激AFs細(xì)胞的VEGF分泌(P<0.05),bFGF、PDGF、AngⅡ?qū)Fs細(xì)胞VEGF分泌影響不顯著(P>0.05)。

      3.3 VEGFR-1在AFs細(xì)胞的表達(dá) 文獻(xiàn)證實(shí)血管外膜成纖維細(xì)胞存在VEGFR-1蛋白表達(dá)[5]。Western blot圖象分析示:TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ均可有效刺激AFs細(xì)胞VEGFR-1表達(dá)增高(n=4,P<0.05)。

      圖3 VEGFR-1蛋白條帶位置在約180kD處。以空白DMEM作對(duì)照,10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激AFs細(xì)胞對(duì)VEGFR-1表達(dá)影響的蛋白免疫分析圖。上圖為蛋白免疫印跡圖譜,下圖為灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照比較,aP<0.05,bP<0.01,n=4。

      3 討論

      既往,人們一直認(rèn)為VEGFRs是局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),許多關(guān)于VEGFRs的研究則都主要圍繞內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行[1]。而后,越來越多的實(shí)驗(yàn)證明VEGF/VEGF受體存在于在許多非內(nèi)皮細(xì)胞。如:許多腫瘤細(xì)胞可表達(dá)VEGF受體。VEGF 2型受體可在造血干細(xì)胞、視祖細(xì)胞上表達(dá)。VEGF 1型受體在單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、腎間充質(zhì)細(xì)胞等均有表達(dá)[1,9-10]。VEGF/VEGF受體在非內(nèi)皮細(xì)胞的這種表達(dá),還能介導(dǎo)細(xì)胞的許多生物學(xué)功能。如存在于單核細(xì)胞上的VEGF 1型受體能調(diào)節(jié)細(xì)胞化學(xué)趨化性及組織因子的釋放[10];VEGF能促使血管平滑肌細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白,促進(jìn)其遷移功能增強(qiáng)等,骨髓祖細(xì)胞上的VEGFR-1介導(dǎo)細(xì)胞活化、動(dòng)員等[11]。而這些細(xì)胞的功能與血管重塑、動(dòng)脈粥樣硬化[1]等慢性炎性病變密切相關(guān)。由此可見,研究VEGF/VEGF受體在非內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有非常重要的意義。

      本研究結(jié)果顯示:血管外膜成纖維細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。為了研究血管外膜成纖維細(xì)胞上的VEGFR-1是否與血管局部的病理改變有關(guān)。選取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ等刺激因素。這些因素的作用與許多血管局部病變密切相關(guān)[12-13]。結(jié)果表明,這些因素均能促使血管外膜成纖維細(xì)胞的VEGF 1型表達(dá)增高,且TGF-β的作用最為顯著,同時(shí)ELISA結(jié)果所示TGF-β能顯著刺激VEGF的分泌。文獻(xiàn)證實(shí)TGF-β可通過影響血管外膜細(xì)胞增殖及肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等機(jī)制從而參與血管重塑[14]。因此推測(cè)VEGF可能也參與了這一機(jī)制。

      在血管壁局部病理情況下,局部細(xì)胞環(huán)境的改變以及局部血管活性物質(zhì)增高可刺激血管外膜成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌[15]增高以及內(nèi)皮生長(zhǎng)因子1型受體表達(dá)增高,而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子則可以自分泌的形式刺激血管外膜細(xì)胞激活,遷移活性增強(qiáng),這可能也是動(dòng)脈粥樣硬化、血管重塑等病變的機(jī)制之一。

      本研究存在一定的局限性。首先,研究結(jié)果未經(jīng)過VEGF特異性拮抗劑拮抗VEGF的功能來證實(shí)。其次,其具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。這將是我們今后進(jìn)一步研究的方向。

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      Objective To explore the expression of VEGF and its receptors in adventitial fi broblasts. Methods Aortic adventitial fi broblasts from Sprague-Dawley (SD) rats were cultured. VEGF were measured in AFs by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), and TGF-β, bFGF,PDGF, AngⅡ on the VEGF secretion. the effect of TGF-β, bFGF, PDGF, AngⅡon the expression of VEGFR-1 was detected by western blot. Results Secretion of VEGF by adventitial fi broblasts. ELISA results showed that the VEGF protein was expressed in cultured serum-free medium (SFM) in time dependent manner(n=4, F=59.538,P=0.000), and TGF-β can signifi cantly increase the VEGF expression. It suggested that VEGF can be secreted from fi broblasts into conditional medium.Western blot results showed that VEGFR-1 was expressed in fi broblasts. TGF-β(n=4,P<0.01) , bFGF, PDGF,AngⅡ(n=4,P<0.05) can increase the VEGFR-1 expression. Conclusion Our results demonstrated the existence of VEGF and its receptor VEGFR-1 in adventitial fi broblasts. This might be an important mediator in the pathogenesis of vascular remodeling.

      VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFR-1(Vascular endothelial growth factor receptor 1), Adventitial Fibroblasts(AFs).

      10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.013

      200051 上海市長(zhǎng)寧區(qū)同仁醫(yī)院 (沈頡)

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