小RNA在精子發(fā)生中的研究進展

郭翠翠綜述 李紅鋼 熊承良審校

華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所、生殖醫(yī)學中心專科醫(yī)院(武漢，430030)

近20年來人們在動物、植物及病毒等生物中發(fā)現(xiàn)了一系列小分子非編碼 RNA，包括 miRNA［1］、piRNA［2］和 siRNA［3］。與其相關的 Argonaut家族蛋白分為2個亞家族:Ago亞家族和Piwi亞家族。精子發(fā)生是指由精原細胞經初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞至成熟精子形成的過程。整個過程分為3個階段:精原細胞的增殖、精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的變態(tài)過程，這一復雜的過程受多種因素的調控。近年來，小RNA在精子發(fā)生中的作用越來越受到人們的重視，現(xiàn)將三種小分子非編碼RNA在精子發(fā)生中調控作用的研究現(xiàn)狀概述如下。

1 3種小分子非編碼RNA簡介

miRNA、piRNA和siRNA都是非編碼的小分子RNA，在轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平等方面調控基因的表達，但它們之間也有區(qū)別:①miRNA和siRNA的長度介于20～25nt之間，而piRNA介于25～30nt之間;②miRNA和piRNA都是單鏈、內源性小分子 RNA，而 siRNA為雙鏈、外源性小分子RNA;③miRNA和siRNA與Ago蛋白家族中的Ago亞家族蛋白相互結合，而piRNA與Ago蛋白家族中的Piwi亞家族蛋白相互結合;④miRNA和siRNA在動、植物的各種組織中基本都有表達，而piRNA的表達具有顯著的組織特異性，目前只在哺乳動物和模式生物，如果蠅的生殖腺細胞及部分干細胞中發(fā)現(xiàn);⑤miRNA和siRNA的生成分別是由前體RNA通過核酸內切酶Dicer1和Dicer2催化產生，但研究表明piRNA的產生過程沒有Dicer1或Dicer2的參與;⑥miRNA主要是對內源性mRNA進行修飾，對機體的生長發(fā)育起重要作用;piRNA的功能主要是維持基因組中轉座子的正常沉默狀態(tài)，以防止基因組中轉座子爆發(fā)而引起相應基因的改變;siRNA主要是封閉和防御外源性DNA對細胞的入侵，如病毒產生的DNA片段，保護機體基因組免受轉座子的破壞和病毒感染，但不參與機體的生長發(fā)育［4］。

2 miRNA與精子發(fā)生

盡管miRNA在精子發(fā)生中的作用仍然是一個未知的領域，但研究表明哺乳動物的睪丸組織中含有大量的miRNA，如Yu等［5］比較小鼠在發(fā)育期前后睪丸組織中miRNA的表達，發(fā)現(xiàn)miR-469、miR-34、miR-16和miR-122a等表達量隨睪丸發(fā)育逐漸增加;2007年Yan等［6］采用miRNA表達譜芯片掃描技術，通過比較未成年與成年小鼠睪丸組織，發(fā)現(xiàn)成年小鼠睪丸組織中有14種miRNA下調，5種上調;2009年Yan等［7］又通過芯片和熒光定量PCR比較了未成年猴與成年猴、未成年猴與成年人睪丸組織，發(fā)現(xiàn)miRNA的表達隨著性成熟不斷增加;2010年Luo等［8］比較miRNA在豬性成熟前后睪丸組織中的表達，發(fā)現(xiàn)成年豬睪丸組織中有51種miRNA上調，78種下調。這些研究提示miRNA可能在精子發(fā)生中起到重要的調控作用，為精子發(fā)生機制的研究提供了一定的幫助。同時研究發(fā)現(xiàn)與miRNA相關的Dicer在精子分化中起重要作用，若敲除Dicer 1，長形精子細胞的形態(tài)和活力將會發(fā)生異常;在睪丸支持細胞中選擇性切除Dicer，可導致精子數(shù)目減少、睪丸功能退化，最終導致不育。近年來對于miRNA在精子發(fā)生中的調控機制也有了一些突破，如最近Yu等［5］研究證明miR-122a通過抑制轉錄蛋白2的表達，在減數(shù)分裂后的精子細胞中起調控作用;Novotny等［9］發(fā)現(xiàn) miR-17-5p在精子形成過程中不斷上調，通過抑制E2F1使生精細胞免受凋亡，利于正常精子的形成;miR-34c通過直接下調TGIF2和NOTCH2，從而在精子發(fā)生的晚期階段起調控作用［10］;miR-18通過作用于熱休克轉錄因子2，以利于精子發(fā)生的正常進行［11］。由于miRNA進化的高度保守性，因此上述miRNA及其調控機制有可能在人類精子細胞發(fā)生過程中也起到類似的作用。

3 piRNA與精子發(fā)生

piRNA僅在精子發(fā)生過程中的粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達，表明其在精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂階段起重要的調控作用。小鼠有3種Piwi蛋白:miwi、miwi2和 mili，全部在睪丸中高表達，在精原干細胞的自我更新和精子細胞發(fā)育中是必不可少的［12］。mili和miwi蛋白出現(xiàn)在小鼠精子發(fā)生的不同階段:mili存在于從精原細胞到粗線期精母細胞發(fā)生階段的生殖細胞中，miwi則存在于從粗線期精母細胞到圓形精子細胞發(fā)生階段的生殖細胞中。任一個Piwi蛋白突變都會影響生殖細胞，導致DNA受損和生殖細胞的凋亡。在雄性小鼠中分別敲除miwi、miwi2和mili的純合子，會出現(xiàn)生精停滯、生殖細胞凋亡。但若分別敲除雌性小鼠的miwi、miwi2和mili純合子，其仍能產生正常后代，這一現(xiàn)象提示miwi、miwi2和mili似乎特異性作用于雄性生殖細胞。mili和miwi2的突變對減數(shù)分裂產生影響，而miwi的突變則影響生殖細胞的成熟。

最近研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶D(MitoPLD)在piRNA的產生過程中起到重要作用，MitoPLD突變的雄性小鼠表現(xiàn)為精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂停滯，去甲基化和反轉錄轉座子去抑制狀態(tài)［13］。與Piwi蛋白相關的MOV10L1(RNA解螺旋酶)優(yōu)先表達于粗線期精母細胞中，在維持轉座子沉默和piRNA的產生中起重要作用，是維持精子發(fā)生和雄性生育力必不可少的重要成員［14，15］。此外，研究表明 Nct1和 Nct2是piRNA的前體物質，主要表達于粗線期精母細胞［16］。Gu等［17］通過對 490 例原發(fā)性無精子或少精子癥患者與468例正常生育力男性比較發(fā)現(xiàn)，Piwi基因的遺傳多態(tài)性也會導致精子發(fā)生缺陷。

4 siRNA與精子發(fā)生

siRNA引發(fā)的轉錄后基因沉默現(xiàn)象即RNA干擾，它廣泛存在于生物體內，是生命基因表達和生長發(fā)育的重要調控手段。在精子發(fā)生的早期階段，利用siRNA沉默Gfra1基因，小鼠精原干細胞將會從自我更新轉變?yōu)橄蚓毎只?，利用siRNA敲除Nodal基因將導致細胞大量凋亡和小鼠精原干細胞分化減少;在精子發(fā)生的晚期階段，通過siRNA特異性敲除Slx和SlxL1基因，使Slx和SlxL1蛋白減少，小鼠生育力明顯下降［18］。在支持細胞中，利用siRNA敲除Pard6a或Par3基因，將導致血睪屏障相關蛋白表達大量減少［19］，而siRNA對beta-1整聯(lián)蛋白的抑制，會導致支持細胞-支持細胞界面上閉鎖蛋白的再分配和血睪屏障的失衡［20］。siRNA還可用于沉默Bcl6b、Erm和Lhx1基因的轉錄，而研究證實這些轉錄因子在體外精原干細胞自我更新中起到重要調控作用［21］。

5 小RNA的應用前景

由于miRNA和piRNA在精子發(fā)生中起重要調控作用，一些miRNA和piRNA特異表達于睪丸組織，在其他組織中不存在，更重要的是piRNA僅表達于精子發(fā)生的中晚期階段，其表達不僅具有時序特異性，還具有細胞特異性，這就為避孕研究提供了生物學基礎，其抑制劑可能用于男性避孕。而對Dicer依賴的調控方式在哺乳動物生殖功能中的作用分析，可為臨床上對不孕的研究和治療打開嶄新的思路。

使用siRNA的RNA干擾技術在探索精子發(fā)生調控中特異基因的功能是極其有效的，主要有3方面的應用:①基礎研究，以進一步檢測在精子發(fā)生調控中起重要作用的基因;②男性避孕，RNA干擾可以作為男性避孕的一種新型的有效工具，可以通過直接注入睪丸siRNA或shRNA來敲除與精子發(fā)生密切相關的基因，從而實現(xiàn)男性避孕;③男性不育的基因治療，通過沉默與疾病相關的基因來達到治療的目的。綜上所述，miRNA、piRNA和siRNA等小分子RNA的發(fā)現(xiàn)是RNA研究領域的一項重大突破，揭示了非編碼區(qū)新的重要調節(jié)機制，隨著研究的不斷展開和深入，miRNA、piRNA和siRNA還可能成為男性生殖系統(tǒng)疾病診斷和預后分析的新型生物學標記，或者模擬其作用進行新藥研發(fā)，為采用小分子干預生殖調節(jié)、治療生殖相關疾病提供新策略。

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