地黃低聚糖對體外培養(yǎng)的小型豬脂肪組織來源干細胞增殖的影響

裴志勇，趙玉生，高偉，尹巧香

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京100700;2.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所;3.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科)

地黃是一味重要的滋陰補腎中藥，大量臨床和實驗研究證實其在免疫、血液及造血、內(nèi)分泌、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理活性。地黃低聚糖(RGOs)系從地黃中提取的低分子量多糖成分，體外研究表明，RGOs具有促進動物骨髓干細胞、骨骼肌成肌細胞增殖、分化的功能［1-3］。脂肪組織來源干細胞(ASCs)是近10年發(fā)現(xiàn)并引起學者們廣泛關注的一種成體干細胞，多項研究表明，ASCs體外可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、平滑肌細胞和肝細胞［4-6］。而關于RGOs與ASCs的研究較少，本文旨在觀察不同濃度RGOs對體外培養(yǎng)的小型豬ASCs增殖的影響，為中藥用于干細胞移植提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 廣西巴馬小香豬，雌雄不拘，體質(zhì)量20～30 kg，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(軍)2007-009。RGOs以生地黃為原料加工后經(jīng)軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所提純，高效液相色譜法檢測RGOs提純物中水蘇糖含量為31.15%。L-DMED培養(yǎng)基、特級胎牛血清(FBS)、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶均購自Gibco公司，DispaseⅡ中性蛋白酶購自Sigma公司，小鼠抗CD31單克隆抗體、小鼠抗CD90單克隆抗體均購自BD PharmingenTM公司，小鼠抗 CD29單克隆抗體、大鼠抗CD44單克隆抗體、小鼠抗CD45單克隆抗體、小鼠抗CD105單克隆抗體、小鼠抗HLA-DR單克隆抗體均購自Abcam公司，大鼠抗CD34單克隆抗體購自Santa cruz公司，細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購自江蘇碧云天生物技術研究所。二氧化碳孵箱(美國Thermo FormaⅡ)，熒光顯微鏡(德國 Leica DM IRB)，酶標儀(澳大利亞Sunrise 1.5)，流式細胞儀(美國BD FACS Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度RGOs培養(yǎng)基的制備 將RGOs提純物1.0 g溶于100 ml含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，配成濃度為10 g/L的培養(yǎng)基母液，倍比稀釋成1 g/L、0.1 g/L、0.01 g/L、0.001 g/L濃度的培養(yǎng)基。

1.2.2 ASCs的分離、培養(yǎng) 無菌條件下取小型豬腹股溝區(qū)脂肪組織5～8 g，冰PBS沖洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊狀;加入20 ml消化液(LDMEM+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%DispaseⅡ中性蛋白酶+0.1%胰蛋白酶)，置于37℃孵箱振蕩消化40～60 min;加入等量含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，100目、200目篩網(wǎng)過濾，600 g離心6 min;棄上清，加入含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，移入培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，去除懸浮細胞，隨后每2～3天換液1次。1周左右細胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察原代及傳代的ASCs形態(tài)學特點。

1.2.3 ASCs的分子表型鑒定 取第4代細胞，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化后PBS重懸細胞并計數(shù)，細胞密度調(diào)至1×106/ml;取9只EP管，分別加入0.5 ml細胞懸液，1000轉(zhuǎn)/min離心5 min，PBS清洗兩遍;0.5 ml PBS再次重懸細胞，加入以下抗體:CD29-FITC、CD31-PE、CD34(一抗)、CD44-FITC、CD45(一抗)、CD90-FITC、CD105-FITC、HLA-DR-FITC(對照加入20 μl PBS)，混勻后4℃冰箱靜置30 min;1900轉(zhuǎn)/min離心8 min，棄上清; CD34及CD45兩只EP管的細胞再次用0.5 ml PBS重懸，加入相應的二抗(均為FITC)，混勻后4℃冰箱靜置30 min，1900轉(zhuǎn)/min離心8 min，棄上清;各管均加入2%多聚甲醛0.5 ml，4℃固定30 min。流式細胞儀進行陽性細胞計數(shù)，每次分析獲取2×104個細胞，Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法測定ASCs的增殖 取第3代細胞，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化后計數(shù)，細胞密度調(diào)至2×104/ml。取9塊96孔板，每塊板分為以下7組:空白對照組，A、B、C、D、E、F組(分別含0 g/L、0.001 g/L、0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L的 RGOs)。每組重復 5孔，每孔加100 μl細胞懸液，外周一圈加入100 μl PBS。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。平衡24 h后吸棄原培養(yǎng)基，根據(jù)不同分組加入不同濃度的RGOs培養(yǎng)基，每2天換液1次。隨后每24 h隨機取一塊96孔板，加入10 μl CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定各孔波長450 nm吸光度(OD450)。計算各組矯正的OD450值，公式如下:矯正的OD450值=不同濃度RGOs組OD450值－空白對照組OD450均值，以時間(d)為橫坐標，矯正的OD450均值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組之間比較先采用F檢驗而后進行q檢驗。

2 結果

2.1 小型豬ASCs的形態(tài)學觀察 原代細胞接種24 h后首次換液，可見大量貼壁細胞，多呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等透明圓泡及細小顆粒。72 h后，細胞較前伸展變大，形狀如前。7 d左右細胞融合達80～90%，可按1∶3傳代。傳代后的細胞數(shù)小時可完全貼壁，生長較迅速，5 d左右可再次傳代。2～3次傳代后細胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2 ASCs表面抗原表達 第4代ASCs表面抗原表達率如下:CD29(99.07±0.28%)、CD44(98.83± 0.56%)、CD90(97.60±0.44%)、CD105(99.31± 0.48%)、CD31(1.95±0.05%)、CD34(2.33± 0.37%)、CD45(1.94±0.04%)、HLA-DR(0.35± 0.02%)。提示第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性。

2.3 不同濃度RGOs對ASCs增殖的影響 如圖1示，小型豬ASCs增殖曲線呈“S”形，前3天細胞增殖緩慢，處于相對靜止期;第4天至第6天細胞增殖迅速，呈指數(shù)增長;第7天至第9天細胞增殖處于平臺期。從第4天開始，不同濃度RGOs對ASCs增殖的影響出現(xiàn)明顯差異，其中D組(0.1 g/L)促增殖作用最明顯，其次是C組(0.01 g/L)，均優(yōu)于A組、B組及F組(均P＜0.05);而E組(1 g/L)的促增殖作用從第6天開始優(yōu)于A組、F組及B組(均P＜0.05);而極低濃度(0.001 g/L)的B組及極高濃度(10 g/L)的F組無明顯的促增殖作用(P＞0.05)。

3 討論

近年來，干細胞移植治療急性心肌梗死及心力衰竭成為心血管領域研究的熱點。目前研究比較多的是骨髓干細胞，尤其是骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)及骨髓單個核細胞。但骨髓干細胞來源有限，取材時痛苦，純化率低;另外，骨髓中干細胞的比例及增殖能力都會隨年齡的增長逐漸下降，因而其廣泛應用受到一定限制。2001年，Zuk等［4］首次從人脂肪組織中分離出成纖維樣細胞群，發(fā)現(xiàn)它可以自我更新，并具有向脂肪、軟骨、骨、肌細胞方向分化的潛能，稱這些細胞為ASCs。與胚胎干細胞、BMSCs、骨骼肌成肌細胞、骨髓造血干細胞相比，ASCs具有以下優(yōu)點:①來源充足，取材方便;②獲取效率高;③體外擴增能力強;④免疫原性極低，可異體移植，不涉及免疫排斥及倫理學問題。以上優(yōu)勢使ASCs逐漸成為近年研究的熱點。

作為一種間充質(zhì)干細胞，ASCs沒有特異性表面標志物。干細胞治療國際協(xié)會-間質(zhì)及組織干細胞委員會［7］針對人的間充質(zhì)干細胞初步制定了4條標準:①可黏附性;②具有成脂、成骨及成軟骨分化的能力;③表達CD73、CD90、CD105;④不表達造血系標志物如c-kit、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD79α、CD19及HLA-DR。CD29即整合素β-1，是骨髓基質(zhì)中重要的黏附分子纖粘蛋白及VACM-1的配體，在介導干細胞歸巢及促進血管形成中起重要作用［8］。CD44即透明質(zhì)酸受體，在細胞基質(zhì)的形成中起了重要作用，與干細胞的黏附、增殖、遷移有關。CD31、CD34是內(nèi)皮細胞的表面標志物，CD31、CD34陰性說明分離培養(yǎng)的ASCs沒有受到脂肪中微血管內(nèi)皮細胞的“污染”。CD45是造血干細胞的表面標志，CD45陰性說明所分離培養(yǎng)的細胞并非來源于循環(huán)中的干細胞。CD105是常用的鑒定細胞具有多方向分化潛能的細胞表面標志。本實驗對所分離、培養(yǎng)的細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，結果顯示細胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105呈陽性表達，而 CD31、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性表達。初步證實本實驗所分離的ASCs具有黏附、增殖、遷移的特性，并具有多向分化的潛能，是脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞。

現(xiàn)代中醫(yī)理論認為，干細胞從產(chǎn)生到發(fā)揮功能均與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中的“先天之精”密切相關［9］。中醫(yī)學的“精”主要有繁衍生殖、生長發(fā)育、生髓化血、濡養(yǎng)臟腑四大功能，這是“精”學說指導中醫(yī)學臨床實踐的主要理論依據(jù)。中醫(yī)經(jīng)典理論認為藏腑中的“腎”是成年個體儲存“先天之精”器官。腎為先天之本，內(nèi)藏五臟之精，主骨生髓，先天之精及后天臟腑之精均歸于腎，對于成年個體而言，中醫(yī)范疇的“腎”是“精”的源泉［10］。因此，具有補腎、益氣、養(yǎng)血功能的地黃可能對干細胞的生物學特性發(fā)揮效應。

RGOs系地黃糖類成分中一類分子量為1 000～3 000的多糖，主要由60%的四糖和20%的三糖構成，水蘇糖是其中的主要成分之一。本研究發(fā)現(xiàn)，RGOs在一定濃度范圍(0.01～1 g/L)內(nèi)可促進體外培養(yǎng)的小型豬ASCs的增殖，最佳濃度為0.1 g/L。本研究還發(fā)現(xiàn)，較高濃度時RGOs的促增殖效應并不隨之增強。這種現(xiàn)象可能與如下因素有關:植物性多糖是一種大分子物質(zhì)，不能自由通過細胞膜，當多糖與受體作用時分子中只有幾個低聚糖片段與受體結合，由此推測多糖也象蛋白質(zhì)和酶一樣，分子中可能存在一個或多個低聚糖片段的活性中心，同樣存在受體飽和現(xiàn)象［11］。另外，中藥的雙向調(diào)節(jié)作用可能也是該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因之一。尹明等［2］研究發(fā)現(xiàn)，RGOs可以促進離體大鼠骨骼肌成肌細胞增殖，最佳濃度為0.625 g/L。王玉紅等［12］研究發(fā)現(xiàn)，0.1 g/L及0.4 g/L兩種RGOs培養(yǎng)基均可以促進人ASCs增殖，其中前者促增殖作用最強。以上研究均說明RGOs在一定劑量范圍內(nèi)可以促進干細胞的增殖，其最佳作用濃度差異可能與物種、干細胞類型以及所提取RGOs有效成分含量不同有關。綜上所述，RGOs是地黃中具有促干細胞增殖作用的活性成分。這不僅為RGOs用于干細胞移植，提高移植療效提供了有力的實驗依據(jù)，并且還為地黃在心血管疾病方面的應用開辟了新天地。