大孔樹脂純化紫花地丁中γ-氨基丁酸的研究

黃美娥，董愛文，郭小玲，林永慧

(1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界427000;2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境學(xué)院，湖南吉首416000)

紫花地丁Viola yedoensisMakino，又名光萼堇菜、地丁菜等，為堇菜科堇菜屬植物［1-2］，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，其野生資源豐富。紫花地丁中含有大量生物活性成分［2-9］，其中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是一種重要的功能性非蛋白組成氨基酸，參與體內(nèi)的多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性，γ-氨基丁酸在醫(yī)藥、食品、飼料中具有廣闊的應(yīng)用前景，2009年9月29日已被中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為可用于食品生產(chǎn)加工的新資源。開發(fā)γ-氨基丁酸產(chǎn)品及其功能性食品、保健品是當(dāng)前食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)擬采用大孔樹脂法分離純化紫花地丁中γ-氨基丁酸，提高其含有量，為進(jìn)一步開發(fā)紫花地丁資源奠定基礎(chǔ)。

大孔樹脂具有高效、低毒的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥材活性成分的提取純化。本實(shí)驗(yàn)首次采用大孔樹脂法對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸進(jìn)行純化，比較7種不同型號(hào)樹脂吸附特性，篩選出最佳樹脂。考察了上樣質(zhì)量濃度、洗脫劑用量、洗脫劑體積流量等工藝參數(shù)，確定了最佳純化工藝條件。

1 材料與儀器

紫花地丁鮮樣采于湖南省張家界市沙堤紫花地丁種植基地，將其洗凈后瀝干，置恒溫干燥箱中50℃干燥，粉碎過(guò)篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

γ-氨基丁酸對(duì)照品SIGMA公司，批號(hào)BCBC3246V;乙醇、苯酚、硼酸、硼砂、氫氧化鈉等均為分析純;D941、LX—17樹脂由西安藍(lán)曉科技有限公司提供;SA—2、732、001×16、AB—8、330樹脂由安徽三星樹脂科技有限公司提供。AEG—220分析天平，日本SHIMADZU公司;UV757紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;R—215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士BUCH公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 γ-氨基丁酸的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制取γ-氨基丁酸對(duì)照品50.0 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備稱取紫花地丁樣品粉末1 kg，加15倍量60%乙醇溶液于40℃浸提2 h，過(guò)濾;重提一次，合并濾液，減壓濃縮，備用。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取對(duì)照品溶液于紫外分光光度計(jì)上，自200～800 nm范圍內(nèi)自動(dòng)掃描，γ-氨基丁酸溶液在600～700 nm區(qū)間有很強(qiáng)的吸收，最大吸收波長(zhǎng)為644 nm，故選擇644 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取1.0 mg/mL對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，定容至刻度，配成0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/m L的對(duì)照品溶液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL γ-氨基丁酸對(duì)照品溶液600 μL，加入硼酸緩沖液(pH9.0)400 μL，6%重蒸酚1 000 μL，混勻，再加入5%NaClO溶液混勻，沸水水浴10 min，冰水冷卻20 min，加入60%乙醇4.0 mL，混勻，于644 nm下測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，得回歸方程A=0.709 6C+0.004 5，R2=0.999 6，表明γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系［10］。

2.1.5 紫花地丁中γ-氨基丁酸的測(cè)定取2.1.2項(xiàng)中供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，測(cè)定紫花地丁供試品液吸光度，試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，計(jì)算樣液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)得0.298%。

2.2 樹脂的預(yù)處理取一定體積的樹脂，先以蒸餾水浸泡12 h，再用40%的NaCl溶液浸泡12 h，然后用2%NaOH攪拌浸泡5 h，水洗至中性，再用5%HCl攪拌浸泡5 h，水洗至中性，最后用70%乙醇浸泡12 h，水洗至無(wú)絮狀物。

2.3 樹脂對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的7種樹脂各1.00 g，裝入具塞磨口三角瓶中，準(zhǔn)確加入0.5 mg/mL的紫花地丁提取液20 mL，于25℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后，過(guò)濾，測(cè)定濾液中γ-氨基丁酸的濃度，按下列公式計(jì)算各樹脂在室溫條件下的吸附量和吸附率。

式中:Q為吸附量(mg/g);E為吸附率(%);C0為吸附前溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V0為吸附前溶液的質(zhì)量體積(mL);V1為吸附后溶液的體積(mL);W為樹脂質(zhì)量(g)。

2.3.2 靜態(tài)解吸試驗(yàn)取按2.3.1項(xiàng)方法吸附飽和的樹脂，用pH值8.5的NaOH溶液10 mL解析24 h后，過(guò)濾，測(cè)定濾液中γ-氨基丁酸的含有量，按下列公式計(jì)算解吸率。

式中:D為解吸率(%);C0為吸附前溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL);C2為解吸后溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V0為吸附前溶液的體積(mL);V1為吸附后溶液的體積(mL);V2為解吸后溶液的體積(mL)［11］。見表1。

表1 7種樹脂對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附率和解吸率(n=3)

由表1通過(guò)比較7種樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附率和解吸率的差異可以看出，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸有較好的吸附率和解吸率。故選用LX-17樹脂為紫花地丁γ-氨基丁酸純化用吸附劑。

2.4 LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

在靜態(tài)吸附的基礎(chǔ)上選擇LX-17樹脂進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。精密量取10 mL LX-17樹脂濕法裝柱，以1.0 BV/10 min流速將質(zhì)量濃度為0.123 mg/mL的紫花地丁提取液上柱，吸附后開始收集流出液，每份收集10 mL，共收集8份，重復(fù)3次，以流出液體積為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，作LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸的動(dòng)態(tài)吸附曲線。見圖1。

圖1 動(dòng)態(tài)吸附曲線圖

由圖1的動(dòng)態(tài)吸附曲線可以看出，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附較快，當(dāng)收集第二管時(shí)吸附率達(dá)94%以上，從吸附達(dá)飽和的時(shí)間和吸附率考慮，LX-17樹脂適宜對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸進(jìn)行純化。

2.5 LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸動(dòng)態(tài)吸附條件的選擇

2.5.1 樣液質(zhì)量濃度的選擇準(zhǔn)確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，分別將質(zhì)量濃度為0.123、0.133、0.156、0.189、0.216、0.257 mg/mL的紫花地丁提取液，以1.0 BV/10 min上樣，重復(fù)3次，考察不同上樣液質(zhì)量濃度時(shí)，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸吸附性能的影響［12］。見圖2。

圖2 樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

由圖2可見，上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率有影響，隨著樣液質(zhì)量濃度的增大，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附率逐漸降低，當(dāng)樣液質(zhì)量濃度為0.123 mg/mL時(shí)，吸附率較大，吸附效果較好，故選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.123 mg/mL。

2.5.2 上柱樣液pH值的選擇準(zhǔn)確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，分別將質(zhì)量濃度為0.123 mg/mL不同pH值的紫花地丁提取液，以1.0 BV/10 min上樣吸附流速上樣，重復(fù)3次，考察不同pH值時(shí)，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附性能的影響［13］。見圖3。

由圖3可見，上樣液的pH值對(duì)吸附率有影響，當(dāng)樣液pH為3.0時(shí)，吸附率較大，吸附效果較好，故選擇上樣液的pH值為3。

圖3 樣液pH值對(duì)吸附率的影響

2.5.3 上柱樣液流速的選擇準(zhǔn)確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，將質(zhì)量濃度為0.123 mg/m L的紫花地丁提取液，分別以0.5、1.0、1.5、2.0 BV/10 min的流速上柱，重復(fù)3次，考察不同上柱流速時(shí)，LX-17樹脂對(duì)紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附性能的影響。見圖4。

圖4 上柱體積流量對(duì)吸附率的影響

由圖4可見，隨著上柱流速的增加，吸附率逐漸下降。由于流速過(guò)快目標(biāo)成分分子來(lái)不及擴(kuò)散并吸附到樹脂內(nèi)表面就已流出，因此上柱流速慢有利于吸附，故選取上樣吸附流速為0.5 BV/10 min。

2.6 紫花地丁中γ-氨基丁酸動(dòng)態(tài)洗脫效果的影響

2.6.1 洗脫劑pH值對(duì)洗脫效果的影響按照最優(yōu)動(dòng)態(tài)吸附條件上柱，充分吸附達(dá)飽和后，依次用pH值為7.5、8.0、8.5、9.0的NaOH溶液洗脫，重復(fù)3次，根據(jù)解吸率的大小確定洗脫劑的最佳pH值。見圖5。

圖5 洗脫劑pH值對(duì)解吸的影響

由圖5可見，洗脫劑pH值對(duì)洗脫效果有影響，洗脫劑pH值在7.5～8.5的范圍內(nèi)，隨著洗脫劑pH值的升高，洗脫液吸光度值逐漸升高，當(dāng)洗脫劑pH值為8.5時(shí)，吸光度值達(dá)最大值，超過(guò)8.5以后，隨著洗脫劑pH值的升高，吸光度值又降低，故選擇洗脫劑pH值為8.5。

2.6.2 不同洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響按照最優(yōu)動(dòng)態(tài)吸附條件上柱，充分吸附達(dá)飽和后，用pH8.5的NaOH溶液分別以0.5 BV/10 min、1.0 BV/10 min、1.5 BV/10 min、2.0 BV/10 min的流速進(jìn)行洗脫，重復(fù)3次，根據(jù)解吸率的大小確定最佳洗脫流速。見圖6。

圖6 洗脫流速對(duì)解吸的影響

由圖6可見，當(dāng)洗脫流速為1.0 BV/10 min時(shí)，洗脫液吸光度值過(guò)最大值，故選擇洗脫劑流速為1.0 BV/10 min。2.6.3洗脫曲線的制作按照最優(yōu)動(dòng)態(tài)吸附條件上柱，充分吸附達(dá)飽和后，讓樹脂充分吸附γ-氨基丁酸。用pH=8.5的NaOH溶液以1.0 BV/10 min流速洗脫，每份收集10 mL，共收集8份，重復(fù)3次。以流出液體積為橫坐標(biāo)，γ-氨基丁酸濃度為縱坐標(biāo)，作洗脫曲線圖。見圖7。

圖7 洗脫曲線圖

由圖7可見，當(dāng)收集第一管洗脫液時(shí)，洗脫液吸光度值最大。隨著洗脫液體積的增加，吸光度值逐漸降低。用3倍樹脂床體積的洗脫劑基本上可將γ-氨基丁酸洗脫下來(lái)，且洗脫峰較集中。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)量取LX-17樹脂50 mL共3份，預(yù)處理后，裝柱。調(diào)整上樣液pH值3.0后，以0.5 BV/10 min的流速上樣500 mL，用pH值8.5的NaOH溶液洗脫3 BV，洗脫流速1.0 BV/10 min，收集洗脫液，減壓濃縮，50℃干燥得γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.16%、15.21%、15.30%的產(chǎn)品。以此提取純化工藝制備γ-氨基丁酸平均收率為5.34%。

3 討論

大孔樹脂技術(shù)在中藥研究中已日趨成熟，應(yīng)用前景日益廣泛。紫花地丁中含有大量生物活性成分，所以γ-氨基丁酸的富集純化存在一定的困難。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)靜態(tài)試驗(yàn)，比較了7種大孔樹脂對(duì)γ-氨基丁酸的吸附和解吸特性，隨后通過(guò)單因素對(duì)比試驗(yàn)，考察了最佳動(dòng)態(tài)吸附和洗脫條件。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，LX-17樹脂適宜紫花地丁中γ-氨基丁酸的純化，按最佳條件進(jìn)行紫花地丁中γ-氨基丁酸的純化可得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.22%的產(chǎn)品，為后續(xù)精制高純度的γ-氨基丁酸產(chǎn)品打下了重要基礎(chǔ)。

［1］任仁安主編.中藥鑒定學(xué)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1986:466.

［2］全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編(上冊(cè))［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:553-554.

［3］肖永慶，畢俊英，劉曉宏，等.地丁化學(xué)成分的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1987，29(5):532.

［4］Xie C，Veitch N C，Houghton P J，et al.Flavone C-glycosides fromViola yedoensisMakino［J］.Chem Pharm Bull，2003，51(10):1204-1207.

［5］劉湘新，劉進(jìn)輝，劉自逵，等.紫花地丁的有效成分分析及抗菌作用研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004(3):16.

［6］白殿罡.紫花地丁揮發(fā)性化學(xué)成分的分析［J］.長(zhǎng)春大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，18(5):69-71.

［7］Zhou Haiyan，Qin Minjian，Hong Junli，et al.Chemical Constituents ofViola yedoensis［J］.Chin J Nat Med，2009，7(4):290-292.

［8］陳胡蘭，董小萍，張梅，等.紫花地丁化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2010，41(6):847-877.

［9］徐金鐘，曾珊珊，瞿海斌，等.紫花地丁化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2010，41(9):1423-1425.

［10］魏珍珍，趙明，李雙容，等.比色法測(cè)定茶葉GABA含量的可行性研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(8):56-58.

［11］劉江波，傅婷婷，呂秀陽(yáng).大孔樹脂分離純化三葉青總黃酮的工藝研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46(4):287-292.

［12］周建軍，曹亮.大孔樹脂分離純化虎杖中蒽醌類化合物工藝研究［J］.中成藥，2011，33(7):1267-1269.

［13］彭亮，李知敏，祝珍芳.大孔吸附樹脂純化蒺藜中總皂苷工藝的優(yōu)化［J］.中成藥，2011，33(5):886-889.