柴胡疏肝散水提液HPLC特征圖譜研究及指標成分的測定

王術玲，賈薇，高曉玲

(廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006)

柴胡疏肝散出自《景岳全書·古方八陣》，由陳皮、柴胡、枳殼、香附、川芎、白芍、甘草七味藥組成，是疏肝理氣的代表方劑，主治脅肋疼痛、寒熱往來?，F(xiàn)代多用于治療抑郁癥［1-4］、高脂血癥［5］、肝脾不和引起的消化系統(tǒng)疾?。?-7］以及一些婦科病［8］等。柴胡疏肝散復方中成分復雜，其化學成分有黃酮、皂苷、生物堿、揮發(fā)油及有機酸等。復方中藥的藥效是由其所包含的成分群的種類及各成分的量共同決定的，特征圖譜能比較全面地反映復方的化學成分體系。因此，本實驗試圖建立柴胡疏肝散的特征圖譜，同時對方中各藥味的指標成分，如白芍的芍藥苷、甘草的甘草苷、陳皮和枳殼的柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷，進行定量分析［9］。

1 儀器與試藥

日本島津LC—20AT高效液相色譜系統(tǒng)，配有SPD—M20A檢測器，SIL—20A自動進樣裝置，DGU—20A5在線脫氣，CTO—10AS VP柱溫箱;電子分析天平(BP—211D型，德國賽多利斯公司);分析天平(LIBROR AEG—220型，日本島津公司)。

芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，甘草酸銨、阿魏酸購自四川省維克奇生物科技有限公司;柴胡、白芍、陳皮、枳殼、川芎、香附、甘草均購于廣州至信藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗符合《中國藥典》2010年版規(guī)定。乙腈為色譜純，超純水自制，其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 色譜條件［10］Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為(A)0.2%磷酸-(B)乙腈，按表1進行梯度洗脫，數(shù)據(jù)采集時間65 min;體積流量1 mL/min;檢測波長為230 nm(芍藥苷)，277 nm(甘草苷)，283 nm(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷);柱溫25℃;進樣量10 μL。在此條件下，對照品及樣品各峰分離度均良好(如圖1)。

表1 流動相梯度Tab.1 G radient of mobile phase

圖1 柴胡疏肝散水提液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Chaihu Shugan Decoction

2.2 對照品溶液的制備精密稱取于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上的芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，加甲醇分別制成0.719 6 mg/mL、0.093 76 mg/mL、2.103 mg/mL、1.440 mg/mL、1.203 mg/mL的對照品貯備液。分別精密吸取上述對照品貯備液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 柴胡疏肝散水提液的制備準確稱取陳皮3.000 g、柴胡3.000 g、川芎2.500 g、香附2.500 g、枳殼2.500 g、芍藥2.500 g、甘草1.500g置回流瓶中，加水200 mL，浸泡30 min，置水浴中加熱回流1 h，濾過，濾液至250 mL量瓶中，用水洗滌藥渣及瓶壁，洗液濾過并入量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液的制備精密量取柴胡疏肝散水提液20 mL至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇24 mL轉移至25 mL量瓶中，超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線性關系考察取混合對照品溶液，分別進樣3、5、10、15、20、30 μL進行測定。以峰面積積分值Y對進樣量X(μg)進行回歸分析，得回歸方程:芍藥苷Y=1 188 694X+2 361，r2=0.999 9;甘草苷Y=1 808 442X+1 719，r2=0.999 9;柚皮苷Y=1 572 505X+46 320，r2=0.999 9;橙皮苷Y=1 739 805X+14 764，r2=1.000 0;新橙皮苷Y=1 867 211X+34 757，r2=0.999 9。表明芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷分別在0.215 9～2.159 μg、0.028 13～0.281 3 μg、0.630 9～6.309 μg、0.432 0～4.320 μg、0.361 0～3.610 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗取同一份柴胡疏肝散供試品溶液連續(xù)進樣6次，以柚皮苷為參照物，17個共有峰的相對保留時間RSD均低于1.0%，以5個指標成分的峰面積計算RSD為芍藥苷1.2%、甘草苷1.3%、柚皮苷1.1%、橙皮苷1.7%、新橙皮苷1.0%，其余共有峰的相對峰面積RSD均小于2.0%，說明精密度良好。

2.7 重復性試驗取同一份柴胡疏肝散水提液平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定，以柚皮苷為參照物，各共有峰的相對保留時間變化均在2.0%之內(nèi)，計算5個指標成分的質(zhì)量濃度及RSD分別為芍藥苷0.084 19 mg/mL(RSD=1.8%)、甘草苷0.028 16 mg/mL(RSD=1.7%)、柚皮苷0.184 2 mg/mL(RSD=1.6%)、橙皮苷0.134 2 mg/mL(RSD=1.8%)、新橙皮苷0.151 4 mg/mL(RSD=1.6%)，其余主要色譜峰的相對峰面積RSD均小于5.0%，說明重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗取同一份柴胡疏肝散供試品溶液，密閉置于室溫條件下放置，分別于制備后0、3、6、9、12 h進樣測定，以柚皮苷為參照物，17個共有峰的相對保留時間的RSD值均低于1.0%，以峰面積計算RSD，結果為芍藥苷1.9%，甘草苷1.9%，柚皮苷1.4%，橙皮苷1.9%，新橙皮苷1.6%，其余共有峰的相對峰面積RSD均小于3.5%，表明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗精密量取同一份柴胡疏肝散水提液10 mL至蒸發(fā)皿中，共6份，分別精密加入一定量的對照品溶液，按2.4項制備，平均回收率結果為芍藥苷96.5%(RSD 2.2%)，甘草苷102.8%(RSD 1.0%)，柚皮苷98.0%(RSD 1.3%)，橙皮苷98.8%(RSD 1.5%)，新橙皮苷99.6%(RSD 1.6%)，見表2。

表2 加樣回收率實驗(n=6)Tab.2 Results of recovery(n=6)

2.10 樣品測定按2.3項制備10份柴胡疏肝散水提液，依法制備供試品溶液并測定，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄0～65 min色譜圖。分別計算5種指標成分，結果為芍藥苷(0.10±0.02)mg/mL、甘草苷(0.030±0.006)mg/mL、柚皮苷(0.24±0.04)mg/mL、橙皮苷(0.14±0.03)mg/mL、新橙皮苷(0.22±0.05)mg/mL。

根據(jù)10份柴胡疏肝散水提液的色譜圖，在230nm檢測波長下共標定17個共有特征峰(如圖2-a)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對測定結果進行評價，17個共有峰的峰面積占總峰面積95%以上，所測樣品的相似度均大于0.95，符合要求。

2.11 色譜峰歸屬按2.3項下方法平行制備單味藥材水煎液及相應的陰性樣品，并按2.4項同法制備供試品溶液，進樣測定。與對照品及全方的色譜圖對比分析，研究17個共有峰的歸屬，見圖2。除5號和7號峰外，其余15個色譜峰都找到對應歸屬藥味(見表3)，提示5號和7號峰有可能是煎煮過程中生成的新成分。

圖2 柴胡疏肝散、單味藥對照及陰性對照的色譜圖(230 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of Chaihu Shugan Decoction，single Chinese medicine and negative samples under the wavelength of 230 nm

3 討論

3.1 本實驗中所測5個指標成分的最大吸收波長不一致，為了增加檢測靈敏度，每個成分均采用各自的最大吸收波長做為檢測波長，即芍藥苷230 nm，甘草苷277 nm，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷283 nm。通過多個波長下全譜圖的比較，認為230 nm下出峰最多、峰形較好、分離度符合要求，所以特征圖譜研究以230 nm做為檢測波長。

3.2 在一般的特征圖譜研究中，由于參比峰與其它峰均存在各自的質(zhì)量分數(shù)變化，雙變量下的相對峰面積控制法的誤差較大，不可控性因素多。本實驗所建立的方法將特征圖譜和幾個主要指標成分的定量測定融合在一起，最終形成的色譜圖化學信息完整，色譜峰分離度好，特征明顯，可以比較全面地控制該制劑的質(zhì)量［11-12］。

［1］林冰，夏進.加味柴胡疏肝散治療抑郁癥臨床研究［J］.新中醫(yī)，2011，43(8):36-37.

［2］劉娟，仲誠.柴胡疏肝散化裁治療中風后抑郁40例［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21(5):788.

［3］牛德斌.柴胡疏肝散對抑郁癥小鼠模型行為學改變影響的實驗研究［J］.中醫(yī)學報，2012，27(6):706-707.

［4］劉蘭英，馮斌，王佩蓉，等.柴胡疏肝散合并文拉法辛對抑郁癥患者血清T淋巴細胞亞群及NK細胞的影響［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2012，29(5):393-397.

［5］常建國.柴胡疏肝散加味治療肝郁氣滯血瘀型高脂血癥［J］，四川中醫(yī)，2010，28(4):72-73.

［6］田玉霞.柴胡疏肝散在中醫(yī)內(nèi)科的臨床運用［J］.中醫(yī)臨床研究，2012，4(8):94.

［7］吳慧，徐有水，劉日才.柴胡疏肝散在消化系統(tǒng)疾病中應用舉隅［J］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2012，22(4):273-275.

［8］程賢英，張慧艷，黃君，等.柴胡疏肝散在婦科病中的應用［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2012，33(2):35-36.

［9］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:80，96，176，229.

［10］王春艷，張丹參，張萬明，等.HPLC-DAD測定柴胡疏肝散中4種活性成分的含量［J］.中成藥，2010，32(3):422-4250.

［11］李婧，劉漢清，孫小芬.丹參注射液多成分定量測定和指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33(4):553-556.

［12］張俐，王玉.鼻炎康片指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33(11):1844-1850.