“一測多評(píng)”法測定麥貞花顆粒中不同類型成分的含有量

劉志輝，顧瑋，常星潔，嚴(yán)冬

(1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046)

麥貞花顆粒由麥冬、女貞子、紅花、槐米等五味中藥組成，具有補(bǔ)益心腎，化瘀通絡(luò)之功效，用于冠心病心絞痛的治療，療效顯著。現(xiàn)代研究表明，女貞子中的環(huán)烯醚萜類成分、紅花中的水溶性色素以及槐米中的黃酮類物質(zhì)均對(duì)心血管系統(tǒng)有較廣泛的藥理作用［1-3］，故選擇女貞子中環(huán)烯醚萜類成分含有量較高的成分之一特女貞苷、紅花中的主要活性物質(zhì)羥基紅花黃色素A和槐米中的蘆丁作為含有量測定指標(biāo)，更能體現(xiàn)中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。特女貞苷對(duì)照品價(jià)格較高且供應(yīng)不足，羥基紅花黃色素A對(duì)照品穩(wěn)定性較差［4］，而蘆丁對(duì)照品廉價(jià)易得又穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用“一測多評(píng)”法［5］實(shí)現(xiàn)麥貞花顆粒的多指標(biāo)質(zhì)量控制，通過建立蘆丁與其他待測成分(特女貞苷、羥基紅花黃色素A)間的相對(duì)校正因子，并與外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果比較，探討“一測多評(píng)”法在不同類型成分之間應(yīng)用的可行性與適應(yīng)性。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀:G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測器，Agilent chemstation工作站;Waters2695高效液相色譜儀:2998PAD檢測器，Empwer工作站。電子分析天平(BP—211D型，德國賽多利斯公司)等。

羥基紅花黃色素A、特女貞苷對(duì)照品(購自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，定量測定用，批號(hào)分別為:ZL20100901HSA和ZL20100928TNZG);蘆丁對(duì)照品(購自中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號(hào)為0080-9705)。測定用甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制取羥基紅花黃色素A、特女貞苷、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為65.80、65.02、318.18 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取麥貞花顆粒約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備陰性供試品溶液。

2.1.3 色譜條件Hedera C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)，洗脫程序見表1;柱溫:30℃;體積流量:1.0 mL/min。HPLC圖見圖1～5。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

圖2 供試品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of samp le

圖3 紅花陰性樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chorm atogram of negative sam p le w ithout Cartham i Flos

圖4 女貞子陰性樣品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chormatogram of negative sam ple w ithout Ligustri lucidi Fructus

圖5 槐米陰性樣品HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of negative sam ple w ithout Sophorae Flos

2.1.4 線性關(guān)系精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、10、15、20 μL進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，分別得羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁的回歸方程見表2。

表2 麥貞花顆粒中3種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standard curves of three active com pounds in Maizhenhua Granules

2.1.5 精密度精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁的峰面積，RSD分別為0.20%，0.29%，0.29%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性取麥貞花顆粒0.5 g，平行6份，精密稱定，按供試品溶液處理方法制備樣品，測定羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.287、3.76、12.24 mg/g，RSD分別為0.20%，0.29%，0.29%。

2.1.7 穩(wěn)定性精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于配制后的0、4、8、12、24 h測定峰面積積分值，羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁24 h內(nèi)峰面積的RSD分別為1.80%、1.20%、0.93%，表明處理后的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 相對(duì)校正因子計(jì)算以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，按公式fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)［5］，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m質(zhì)量濃度。分別計(jì)算蘆丁對(duì)特女貞苷和羥基紅花黃色素A的校正因子，見表3。

表3 蘆丁對(duì)特女貞苷和羥基紅花黃色素A的校正因子Tab.3 Correction factor of rutin on specnuezhenide and hydroxysafflor yellow A

2.2.1 校正因子重現(xiàn)性考察取混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15 μL，計(jì)算蘆丁對(duì)特女貞苷、羥基紅花黃色素A的校正因子。實(shí)驗(yàn)考察了Waters2695-2998、Agilent1100兩種高效液相系統(tǒng)，Hedera C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Sunfire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)4種色譜柱，結(jié)果見表4。

表4 不同儀器和色譜柱測得校正因子(n=3)Tab.4 Correction factor measured by using different instruments and chromatographic columns(n=3)

2.3 待測組分色譜峰定位計(jì)算各待測組分與內(nèi)參蘆丁的相對(duì)保留值(r)，結(jié)果見表5。

表5 不同儀器和色譜柱測得的相對(duì)保留值(n=3)Tab.5 Relative retention measured by using different instruments and chromatographic columns(n=3)

由表可知，RSD＞5%，說明其在不同儀器和不同色譜柱上的重復(fù)性較差，用相對(duì)保留時(shí)間定位缺乏準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用色譜法結(jié)合光譜方法對(duì)待測色譜峰進(jìn)行定位，羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁的紫外吸收光譜圖見圖6。

雖然相對(duì)保留時(shí)間在不同儀器和色譜柱上的重復(fù)性較差，但是出峰順序一致，由圖6可知，3種成分的紫外吸收特征相差較大，且本制劑在測定波長下色譜峰較少，待測成分色譜峰附近無干擾，用色譜法結(jié)合光譜法進(jìn)行待測色譜峰的定位是可行的。

2.4 一測多評(píng)法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較分別精密吸取不同批次制劑供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定。采用外標(biāo)法和一測多評(píng)法計(jì)算麥貞花顆粒中蘆丁、羥基紅花黃色素A和特女貞苷的含有量，結(jié)果見表6。

圖6 3種對(duì)照品的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.6 UV absorption spectrum of three reference substances

表6 麥貞花顆粒中蘆丁、羥基紅花黃色素A和特女貞苷含有量(n=3)Tab.6 Contents of rutin，hydroxysafflor yellow A and specnuezhenide in M aizhenhua Granules

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用一測多評(píng)方法及外標(biāo)法所測得的麥貞花顆粒中蘆丁、羥基紅花黃色素A和特女貞苷的含有量基本一致，表明兩種含有量測定方法得到的含有量值之間無顯著性差異，說明一測多評(píng)法在麥貞花顆粒的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。

3 討論

中藥多成分、多功效的作用特點(diǎn)決定著單一成分難以表達(dá)中藥的質(zhì)量，多成分同步質(zhì)量控制模式應(yīng)運(yùn)而生，并得到了迅速普及。在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)過程中，多采用指紋圖譜技術(shù)來體現(xiàn)中藥的系統(tǒng)性、整體性、特征性［6］，但它模糊的特點(diǎn)造成了在實(shí)際生產(chǎn)、監(jiān)督中的應(yīng)用難度和“難以說清楚”［7］。一測多評(píng)法用校正因子闡明了中藥主要成分間的相互關(guān)系，能夠?qū)崿F(xiàn)在對(duì)照品短缺的情況下，進(jìn)行多指標(biāo)成分的含有量測定，有望成為適合中藥特點(diǎn)多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式。

3.1 內(nèi)參物的選擇羥基紅花黃色素A為水溶性色素成分，穩(wěn)定性差，溶液狀態(tài)下易降解［8］，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)照品溶液一段時(shí)間后峰面積有所降低，影響含有量測定的準(zhǔn)確度。特女貞苷價(jià)格較昂貴，而蘆丁對(duì)照品廉價(jià)易得又穩(wěn)定，在制劑中含有量較高，因此選擇蘆丁為內(nèi)參物來實(shí)現(xiàn)制劑中3種成分的同時(shí)測定，更能體現(xiàn)一測多評(píng)方法的簡便、易操作、低成本。

3.2 檢測波長的選擇羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁的最大吸收波長見圖6，曾選擇三者的共有波長區(qū)即230 nm處進(jìn)行測定，在不同儀器試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)羥基紅花黃色素A的校正因子重現(xiàn)性較差，RSD＞5%。故在梯度洗脫過程中采用可變波長檢測，前15 min選擇羥基紅花黃色素A的最大吸收403 nm。因特女貞苷與蘆丁保留時(shí)間相近，考慮到不同儀器和色譜柱對(duì)保留時(shí)間的影響，故后30 min選擇特女貞苷最大吸收波長230 nm進(jìn)行檢測，校正因子重現(xiàn)性良好。

3.3 關(guān)于色譜峰定位目前一測多評(píng)方法中色譜峰定位一般采用色譜法，楊芳等［9］根據(jù)內(nèi)參物歐前胡素的保留時(shí)間，利用色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行川白芷藥材中另外2個(gè)香豆素成分定位，此方法較為簡便，在待測化合物的化學(xué)性質(zhì)相近的情況下使用實(shí)用性較好。但是對(duì)于不同類型化合物，采用色譜法定位誤差較大，對(duì)化學(xué)性質(zhì)相差較大的待測化合物而言，其紫外吸收特征差別也較大，此時(shí)可采用光譜法結(jié)合色譜法進(jìn)行定位。王瑞等［10］根據(jù)內(nèi)參物芍藥苷的保留時(shí)間，通過相對(duì)保留值結(jié)合待測組分色譜峰的紫外吸收特征，能夠正確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。本制劑中羥基紅花黃色素A、特女貞苷和蘆丁3種成分的紫外吸收特征相差較大，且在特定色譜條件下色譜峰較少，干擾較小，這為光譜法定位提供了可能，再結(jié)合色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，即可正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。

3.4 關(guān)于制劑的一測多評(píng)中藥復(fù)方制劑較之于單味中藥飲片而言成分種類更多、更復(fù)雜，因此，其一測多評(píng)的應(yīng)用難度加大。若譜圖中色譜峰較多，僅采用色譜法或光譜法都無法滿足準(zhǔn)確定位的要求。近年來李博巖等［11-12］提出了光譜相關(guān)色譜的新概念，即利用聯(lián)用色譜的光譜信息與色譜信息，判斷復(fù)雜中藥色譜圖中的組分相關(guān)性和表征不同實(shí)驗(yàn)條件下所得的中藥色譜圖，從而實(shí)現(xiàn)儀器的系統(tǒng)誤差的化學(xué)計(jì)量學(xué)校準(zhǔn)，使“一測多評(píng)”法在復(fù)雜中藥制劑中的應(yīng)用成為可能。也可以按制劑中成分種類及理化性質(zhì)不同，進(jìn)行相應(yīng)的提取、分離、純化等，建立兩個(gè)或兩個(gè)以上的一測多評(píng)的方法以進(jìn)行更多成分的測定。

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