缺氧后胚鼠神經(jīng)元自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

陳 艾， 周 暉， 童 煜， 毛 萌

缺血缺氧性腦損傷是兒科常見疾病之一，可累及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的多個區(qū)域而遺留永久性的損傷，成活者常遺留腦癱、智力低下等嚴(yán)重后遺癥［1，2］。但缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其有效干預(yù)措施也有待探索。自噬是繼壞死、凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，被稱為Ⅱ型程序化死亡。自噬、凋亡、壞死3種現(xiàn)象在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下的發(fā)生秩序一直是國內(nèi)外爭論的熱點。

本研究旨在觀察缺氧致胚鼠神經(jīng)元損傷后，自噬以及凋亡的發(fā)生及變化情況。為進(jìn)一步研究自噬和凋亡的關(guān)系，以及兩者對缺血缺氧性腦病的影響提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 3只17～19d SD孕鼠，清潔級，體質(zhì)量350～400g，每次使用8只胚鼠，分3次培養(yǎng)神經(jīng)元。由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供［生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2004-15］。

1．2 主要試劑 多聚-D-賴氨酸、鼠尾膠原(Sigma，美國);高糖培養(yǎng)基、神經(jīng)A培養(yǎng)基、B-27神經(jīng)刺激因子、兔源LC3 I/II單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體(賽信通，美國);鼠源actin單克隆抗體、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(中杉金橋，北京);雙抗(100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)、高糖DMEM、10%胎牛血清(Hyclone，美國)。

1．3 主要設(shè)備 24孔塑料培養(yǎng)板(潔特生物，廣州)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，厭氧培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，超凈工作臺(Artech，加拿大)。

1．4 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 無菌條件下分離胚鼠大腦皮質(zhì)，經(jīng)去除腦膜、胰酶消化后，以1．6～1．8×106/ml的密度接種，接種培養(yǎng)基為高糖DMEM，加10%胎牛血清、1%glutamax、雙抗，放入 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。4h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)基，之后每3d半量換液，至7d神經(jīng)元成熟。

1．5 神經(jīng)元缺氧模型的建立 選用培養(yǎng)7d生長良好的神經(jīng)元，放入國產(chǎn)厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～6h，厭氧培養(yǎng)條件為 37℃、1%O2。

1．6 蛋白樣品的制備及Western blot檢測 提取細(xì)胞總蛋白后用BCA法定量。分別取25μg樣品進(jìn)行電泳(15%SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)。先后用 LC3 I/II(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)以及Actin(1∶1000)的一抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)進(jìn)行雜交，洗膜后使用Immobilon Western化學(xué)發(fā)光底物(Millipore，美國)在化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad公司)中顯影。所得結(jié)果用Gel-pro Analyzer軟件分析。

1．7 神經(jīng)元免疫熒光 選取體外培養(yǎng)7d生長良好的大鼠皮層神經(jīng)元，吸凈培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS液洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗滌后用 0．2%TritonX-100/PBS 于 4℃ 下處理 15min，5%BSA封閉30min，滴加一抗小鼠源MAP2(1∶200)、GFAP(1∶200)，濕盒中4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加抗小鼠的IgG-FITC(1∶200)，避光室溫孵育1h，DAPI(1∶500)避光1min，PBS充分洗滌后50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。以MAP2陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示神經(jīng)元細(xì)胞純度。

1．8 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS13．0軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0．05，以P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

2．1．1 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 正常神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，胞體發(fā)亮，周邊可見明顯光暈，表明細(xì)胞活性很好，突觸伸展成多極、雙極，交織成網(wǎng)狀(見圖1A)。OD 3h導(dǎo)致神經(jīng)元突觸回縮，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞(見圖1B)。OD 6h后神經(jīng)元碎片化，突觸膨脹斷裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)幾乎消失(見圖1C)。

2．1．2 免疫熒光鑒定 原代神經(jīng)元鑒定MAP2標(biāo)記的成熟神經(jīng)元顯示綠色熒光，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，樹突及軸突舒展(見圖2A)。OD 3h后神經(jīng)元胞體不再飽滿度，突觸回縮斷裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞(圖2B)。OD 6h神經(jīng)元感光度降低，突觸膨脹斷裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)幾乎消失(見圖2C)。GFAP陽性表達(dá)的為星形膠質(zhì)細(xì)胞(見圖2D)，計數(shù)十個視野范圍內(nèi)的100個細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞沾染率＜5%。

2．2 缺氧能明顯誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象的發(fā)生 缺氧可以明顯誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。與OD 0．5h皮質(zhì)神經(jīng)元對比，隨缺氧時間延長，LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)換明顯增多，尤其在OD 4h時出現(xiàn)高峰，LC3-II/Actin(OD)=0．8228 ±0．012，之后逐漸減弱。至 OD 6h，神經(jīng)元細(xì)胞幾乎碎裂。OD 0．5h～OD 3h與OD 4h～OD 6h的LC3-II/actin均值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)。

缺氧明顯誘導(dǎo)自噬發(fā)生的同時，凋亡現(xiàn)象也出現(xiàn)。casapase-3表達(dá)趨勢在 OD 4h內(nèi)與 LC3-II一致，但OD 4h～OD 6h時，LC3-II的表達(dá)不再增加，出現(xiàn)平臺期，而caspase-3的表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)(見圖3)。

3 討論

3．1 自噬 自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體/噬泡降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程［3］。自噬在進(jìn)化過程中有高度的保守性，是繼壞死、凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，參與了如神經(jīng)退行性改變、精神分裂等多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病過程［3］。自噬可清除受損的細(xì)胞器，同時降解被包裹的蛋白質(zhì)、核酸等成分，產(chǎn)生氨基酸和核苷酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生小分子和能量(ATP)，被細(xì)胞再利用。這樣就實現(xiàn)了細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞反應(yīng)，它的這種精細(xì)調(diào)節(jié)對維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)有重要作用，所以體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞中均有基礎(chǔ)水平的自噬現(xiàn)象存在［4］。

事實上，自噬是一個動態(tài)的過程，包括3個階段:(1)前自噬泡形成:胞漿中大量膜性結(jié)構(gòu)形成;(2)自噬泡形成:膜性結(jié)構(gòu)包裹受損的細(xì)胞器等形成獨立的小泡;(3)自噬泡降解:自噬泡的外膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，最終溶酶體酶逐漸消化被包裹的各種小分子物質(zhì)，產(chǎn)生能量供機(jī)體再利用［5］。在神經(jīng)元遭受缺氧損傷后，自噬發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面，自噬的過度激活可能介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡［6］;另一方面，自噬的啟動可能有助于維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，減少繼發(fā)損傷，清除已經(jīng)被損傷的細(xì)胞器而保護(hù)神經(jīng)元。

圖1 光鏡結(jié)果(×400)

圖2 免疫熒光化學(xué)染色(×400)

圖3 OD處理后皮質(zhì)神經(jīng)元LC3II及caspase-3的表達(dá)趨勢

在所有的Atg蛋白中，目前認(rèn)為只有LC3/Atg8貫穿于自噬發(fā)生的始終，可作為自噬的監(jiān)測標(biāo)志［7］。LC3有4種亞型(LC3 I-IV)，其中LC3II因表達(dá)最多而成為最廣泛的自噬監(jiān)測指標(biāo)。自噬發(fā)生時，LC3的C端被Atg4剪切后鏈接一個甘氨酸殘基即成為LC3I，彌散存在于胞質(zhì)。再通過類泛素化酶反應(yīng)，催化偶聯(lián)磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，成為 LC3-II(LC3-PE)，聚集于自噬體內(nèi)外膜上。因此，常以LC3II來衡量自噬的發(fā)生［8］。

我們已有實驗結(jié)果證實，腦細(xì)胞對缺氧非常敏感。隨著缺氧時間的逐步延長，神經(jīng)元死亡及凋亡的比率明顯增加。尤其以缺氧3～5h最為顯著，缺氧6h后，神經(jīng)元幾乎死亡［9］。因此，我們選擇了神經(jīng)元缺氧最為敏感的6h內(nèi)作為觀察時間，在神經(jīng)元遭受缺氧損傷后應(yīng)用Western blot檢測LC3蛋白水平的變化以觀察自噬的發(fā)生。

我們觀察到，未缺氧處理時，LC3II的表達(dá)在OD 0h有一個波峰出現(xiàn)，考慮為細(xì)胞在提取蛋白的過程中受到了溫度、缺氧、細(xì)胞破碎等劇烈應(yīng)激變化所致。

缺氧后的細(xì)胞，由于已經(jīng)有0．5h處于應(yīng)激耐受狀態(tài)，可能激發(fā)了細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，所以 OD 0．5h的LC3II的表達(dá)量反而比 OD 0h還低。OD 0．5h～OD4h，LC3II表達(dá)相對穩(wěn)定，處于第一個平臺期(P＜0．05)，OD 0．5h ～OD 4h 組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。隨著時間的推移，LC3II表達(dá)逐漸增加，于OD 4h跳躍式到達(dá)峰值，之后在OD 4h～OD 6h處于第二個平臺期，LC3II表達(dá)不再上調(diào)。OD 4h-OD 6h與OD 0．5h～OD 4h的數(shù)值均值比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

我們知道，在臨床工作中，當(dāng)卒中、新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)等缺血缺氧性腦病發(fā)生時，最佳的搶救時間是發(fā)病后4h以內(nèi)，被稱為治療的最佳時間窗。之前尚未有研究提示，缺氧應(yīng)激后4h之內(nèi)存在自噬現(xiàn)象的發(fā)生。以上數(shù)據(jù)提示，自噬所介導(dǎo)的信號通路，也是缺血缺氧性腦損傷4h內(nèi)觸發(fā)的瀑布式病理生理機(jī)制之一。此實驗結(jié)果，佐證了只有盡量爭取在缺氧導(dǎo)致起病4h內(nèi)［1］，LC3II處于第一個平臺期時，才能得到更好的治療效果。同時，也提示臨床醫(yī)生，是否能將LC3II的時間依從性表達(dá)趨勢作為臨床判斷缺血缺氧性腦損傷預(yù)后的依據(jù)之一。

3．2 凋亡 caspase-3是凋亡的標(biāo)志蛋白，一般認(rèn)為，只有分子量為35bp的caspase-3被激活成17或19bp的小片段時，才能體現(xiàn)凋亡的發(fā)生［10］。因此，我們選取被激活的caspase-3(19bp)為檢測凋亡的指標(biāo)。從圖3可以看出，缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生自噬的同時，凋亡也被激活，casapase-3(19bp)表達(dá)趨勢在OD 4h內(nèi)與LC3II的表達(dá)趨勢一致。但是，當(dāng)缺氧應(yīng)激持續(xù)存在，在OD 4h～OD 6h時，LC3-II表達(dá)量不再升高，而casapase-3(19bp)表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)。因此，我們認(rèn)為，當(dāng)自噬不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)時，凋亡增強(qiáng)，最終神經(jīng)元出現(xiàn)壞死。因此，當(dāng)沒能及時在缺氧應(yīng)激后4h內(nèi)得到有效治療的臨床患者，病程后4～6h的治療或許應(yīng)該以抗細(xì)胞凋亡為主。

3．3 小結(jié) 目前，對細(xì)胞3種程序化死亡現(xiàn)象發(fā)生的時間順序仍有爭議［10］，有觀點認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞遭遇應(yīng)激時，自噬最先被激活，當(dāng)自噬不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)后，細(xì)胞再繼發(fā)凋亡，最后進(jìn)入壞死，這種順序是不可逆的［11］。也有觀點認(rèn)為，自噬與凋亡重疊發(fā)生，平行執(zhí)行功能，互為補(bǔ)充，共同維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，抵御應(yīng)激損傷。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬與凋亡在某段時間內(nèi)并存，尤其是在應(yīng)激后的4h內(nèi)，這為臨床干預(yù)的“時間窗”學(xué)說提供新的理論依據(jù)。

本實驗研究也提示，既然在缺氧損傷等應(yīng)激下，細(xì)胞會啟動自噬機(jī)制來維持自身穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞對低氧的耐受力，那么調(diào)控自噬這種細(xì)胞自身的促生存機(jī)制，或許能夠作為應(yīng)對缺氧損傷的新策略。如有文獻(xiàn)報道，大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加，提示其可能參與了缺血后神經(jīng)保護(hù)［12］，那么，提前應(yīng)用外源性BDNF可能會改善缺氧應(yīng)激疾病的預(yù)后。

其次，監(jiān)測LC3II的動態(tài)變化，可望作為指導(dǎo)臨床用藥的依據(jù)和判斷預(yù)后的指標(biāo)。比如，病程4h內(nèi)治療以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)自噬為主，預(yù)后較好;而當(dāng)病程進(jìn)展至4～6h，患者才得以救治的話，治療應(yīng)該以抗凋亡為主，且預(yù)后相對較差。缺氧啟動自噬的信號通路如何，哪些位點參與具體調(diào)控，在治療此類腦損傷的過程中，是否能預(yù)防性激活自噬、加強(qiáng)自噬的功能以保護(hù)神經(jīng)元，將是我們實驗組下一步研究的內(nèi)容。

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