GABRA3基因rs12688628位點G/T多態(tài)性與甲亢性低鉀性周期性麻痹的相關性研究

羅成宏，崔玉真，朱東銘，朱永瑤，付倫姣，楊 媚，蘇斌儒，陳月富，陸偉恒，許鵬杰，肖 波

甲狀腺功能亢進性周期性麻痹(Thyrotoxic Hypokalemic Periodic Paralysis，THPP)是以突發(fā)、復發(fā)及可逆發(fā)作的肌肉無力為特征的一種疾病，作為甲狀腺功能亢進的并發(fā)癥，THPP在西方國家很少發(fā)生，但在亞洲男性中，發(fā)病率可達10%［1］。至今為止，THPP中男性占優(yōu)勢以及種族差異的原因仍然令人費解。GABRA3基因為編碼GABA受體α3亞單位的基因，是氯通道蛋白家族的一員，該基因高度表達于神經細胞和神經肌肉接頭處，且另有研究表明GABRA3表達于骨骼肌的多個位點，其基因突變有可能影響了神經肌肉接頭處遞質的傳遞，從而導致乏力的發(fā)生。有趣的是GABRA3基因位于X染色體上，該基因與THPP的男性優(yōu)勢發(fā)病有無內在聯(lián)系，值得我們進一步探討。本研究選取GABRA3基因3號內含子rs12688628(G/T)多態(tài)性與中國南方男性甲亢性周期性麻痹的的相關性進行了探討。

1 資料與方法

1．1 研究對象 本研究選取本院神經內科、內分泌門診及住院男性患者，根據典型臨床表現(xiàn)，甲狀腺功能測定結果及血鉀測定結果，分成THPP組(35例)、GD組(35例)，HPP組(25例)，其中包括腎小管酸中毒3例，原發(fā)性醛固酮增多癥4例，嗜鉻細胞瘤3例，家族性低鉀周期性麻痹2例，原因不明低鉀周期性麻痹13例，以及另選健康人群組成NC組(35例)。THPP組患者，年齡17～56歲，平均29．81±10．26歲，診斷標準:(1)甲亢的臨床表現(xiàn)及甲狀腺功能檢測TSH↓，F(xiàn)T4、FT3↑;(2)急性肌無力(不能行走);(3)發(fā)作時血 K+＜3．5mmol/L;(4)排除其他導致低鉀血癥疾病所致的低鉀性麻痹。HPP組患者，年齡21～62歲，平均 31．15±12．26歲，診斷標準:(1)急性肌無力(不能行走);(2)發(fā)作時血K+＜3．5mmol/L;(3)排除利尿劑、瀉藥、激素等藥物以及甲狀腺功能亢進導致的低鉀周期性麻痹。GD組患者，年齡 20～60歲，平均 30．27±11．74歲，Graves’病診斷標準:(1)甲狀腺功能亢進診斷成立;(2)甲狀腺腫大成彌漫性;(3)無低鉀性麻痹的臨床表現(xiàn)，血鉀在正常范圍(3．5～5．5mol/L)，無低鉀及癱瘓發(fā)生。NC組，年齡19～53歲，平均27．19±10．43歲，主要來源于本院職工、學生及體檢中心相匹配的健康人群。常規(guī)體檢TSH、FT4正常(0．27＜TSH ＜4．2mU/L，12．0 ＜FT4 ＜22pmol/L)，并且排除高血壓病、心、肝、肺、腎腫瘤等疾病，無甲狀腺功能亢進或低鉀周期性麻痹家族史。入選對象均為來自廣東、廣西、江西、湖南、四川、福建等省無血緣關系的漢族人群，4組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

1．2 實驗方法

1．2．1 DNA 的提取 EDTA抗凝全血5ml，置于－80℃冰箱保存，后集中標本使用BloodZol試劑盒提取DNA。

1．2．2 GABRA3基因多態(tài)性分析 使用巢式PCR擴增包含rs12688628片段。一次PCR(目的片段)，引物序列為 F:5’TTTCTATGAGGCTGGCTAT 3’;R:5’TAAACAGGTTGCTTACGG 3’。DNA 樣本經 HhaI(Promega，HhaI，10U，10g/L 牛血清蛋白0．2μl，10 ×緩沖液2μl，DNA 樣品 10μl，加去離子水至總體積20μl)37℃消化3h后;65℃孵育 20min以終止反應;然后在 PT-200型熱循環(huán)儀上進行巢式PCR擴增．反應體系為 50μl，含10mmo l/L dNTP(GibcoBRL)4μl，10 × 緩沖液 5 μl，50mmo l/LMgC l 1．5μl，Taq DNA 聚 合酶(G ibcoBRL)1．25U，20pmol/L引物 1 μl，DNA 樣 品 5 μl．。95℃ 5 m in預變性后，95℃變性30s，58℃淬火 2 0s，72℃ 延長 1 min，共 1 5個循環(huán)，72℃延長 10min;二次 PCR(目的片段140bp)，引物序列:F:5’AGTGATGGCACAAGAATCAGTCCTT 3’;R:5’CAGATGTTTCATTCTTAATG 3’。反應結束后取PCR產物配成酶切反應體系，其中 P CR 產 物10μl、緩沖液2μl、內切酶 3 U，加 d dH2O至20μl體系，37℃酶切4h，65℃ 10min 終止酶切反應，內切酶為EcoNI(NEB R0521L)，25g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳圖譜進行基因分型。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件和遺傳學數理統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析，所得數據以±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗及方差分析?；蛐驮诎l(fā)病危險性中的比較均使用χ2檢驗/Fisher確切概率法檢驗。比值比(odds radio，OR)估計等位基因型對 THPP發(fā)病的相對危險性，按 Hardy-Weiberg平衡法檢測樣本的群體代表性。P≤0．05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 GABRA3基因DNA提取結果及巢式PCR擴增目的片段 見圖1。

圖1 GABRA3基因DNA提取結果及巢式PCR擴增目的片段圖

表1 THPP組、HPP組、DG組及NC組患者一般情況分析表

表2 THPP組與其他對照組在rs12688628位點的基因型比較

2．2 基因擴增酶切產物結果 本研究研究對象為男性，GABRA3基因位于X染色體上，因此每個個體均只有1個等位基因，基因型分為兩型。rs12688628 PCR產物酶切后呈2種等位基因型。突變不被酶切(保持140bp)，為T基因型，沒有突變被酶切成113bp及27bp兩條帶，為 G型，因27bp太小，瓊脂糖電泳無法檢測到，故以上基因型的條帶相應減少1條。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測GABRS基因內含子rs12688628擴增酶切產物圖

2．3 各組患者臨床特征 如表1所見。4組患者年齡組間比較無統(tǒng)計學意義。發(fā)作時，THPP組與HPP組血鉀水平均明顯低于正常水平(3．5mmol/L)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義?；A狀態(tài)下(THPP組與HPP組為補鉀后或未發(fā)作時)，THPP組、HPP組與GD組兩組間比較沒有統(tǒng)計學意義;THPP組的TSH與HPP組、NC組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(均為P＜0．05)，GD組與HPP組、NC組比較也是降低的，有統(tǒng)計學意義(均為P＜0．05)，其他兩組間無統(tǒng)計學意義;THPP組FT4與其他3組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均為P＜0．05)。GD組與HPP組、NC組比較同樣是升高的，有統(tǒng)計學意義(均為P＜0．05)。其他兩兩組間無統(tǒng)計學意義;THPP組FT3與HPP組比較是升高的，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，GD組與HPP組比較也是升高的，有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，而其他兩組間無統(tǒng)計學意義。

2．4 4組患者等位基因頻率比較 按Hardy-Weinberg平衡定律對研究總人群基因頻率進行平衡檢驗 χ2=3．62，df=1，P ＞ 0．05，同時對 THPP 組、HPP組、DG組及NC組進行平衡檢驗顯示，THPP組χ2=0．75，df=1，P ＞0．25;HPP 組 χ2=0．64，df=1，P＞0．5，DG 組 χ2=0．74，df=1，P ＞0．25，NC 組 χ2=0．44，df=1，P ＞0．5，均符合 Hardy-Weinberg 平衡。由表2可見rs12688628位點THPP組G等位基因頻率均高于其他組，與DG組、NC組有顯著差異，但與HPP組無顯著差異，rs12688628位點G等位基因攜帶者相對GD組患THPP的危險性顯著增高(OR=15．13)，相對 NC組患病危險性也增高(OR=5．56)。

3 討論

近年來基因多態(tài)性與THPP的相關性研究主要集中在3個通道蛋白基因:CACNA1S、SCN4A、KCNE3，分別為編碼骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因。編碼CACNA1S的基因被確認為是家族性低鉀性周期性麻痹(Family hypokalemic Periodic Paralysis，F(xiàn)HPP)的致病基因，其具有3個錯義突變R528H、R1239H、R1239G［2］，但是在 THPP 的研究中未發(fā)現(xiàn)這3個位點的突變［3，4］。研究者們在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)THPP患者CACNA1S基因11號外顯子具有基因多態(tài)性，Kung AW等［5］在研究中國香港地區(qū)人群97例THPP患者CACNAIS基因11號外顯子的多態(tài)性時，發(fā)現(xiàn)了1491AAC/AAT、1551GGT/GGC、1564CGT/TTG。1551T→C的等位基因C頻率分別為 17%(THPP)、19%(GD)和 44%(NC)，1564C→T的等位基因T頻率分別為2%(THPP)、3%(GD)和4%(NC)，但 THPP組與 Graves’病組及正常對照組相比，兩個多態(tài)位點均無統(tǒng)計學意義。在SCN4A、KCNE3的基因突變研究中未發(fā)現(xiàn)陽性結果。

本研究發(fā)現(xiàn)THPP組rs12688628的G等位基因高于NC組、GD組，且有統(tǒng)計學意義，與泰國Jongjaroenprasert等人報道［6］一致。rs12688628 基因位點的多態(tài)性位于X染色體GABRA3基因的3號內含子中，眾所周知，THPP多發(fā)生于男性，X染色體基因的多態(tài)性也許可部分解釋這種臨床特征。該位點與THPP的相關性提示可能附近存在其他的致病等位基因，或者該位點本身就是THPP的致病易感基因，這種多態(tài)性可以調節(jié)GABRA3或附近基因的表達。以往有多囊卵巢的內含子基因可通過表達后調節(jié)另一個下游基因的表達導致該病發(fā)生的報道。GABRA3基因是氯通道蛋白家族的一員。該基因高度表達于神經元及神經肌肉接頭處，它的突變在Rett綜合征中有所報道［7］，在基因表達庫中，也明確指出GABRA3可表達于骨骼肌的多個位點［8］。甲狀腺功能亢進本身被認為是THPP患者發(fā)病的一個始動因素。有動物實驗證明甲狀腺素水平可影響GABAR基因分子的轉錄，影響其與GABA受體在神經元組織及神經肌肉接處的結合位點［9］，然而目前還沒有體內實驗直接證實甲狀腺素對肌細胞中GABA受體表達的影響，因此GABA受體在THPP患者中的作用還不明了，功能研究有待展開進一步闡述。

與HPP組相比，雖THPP組G等位基因頻率高于后者，但統(tǒng)計分析比較無明顯差異，該結果也許提示GABRA位點的多態(tài)性使眾多原因導致的低鉀性周期性麻痹患者殊途同歸，簡言之，GABRA的位點多態(tài)性使患者易患低鉀性麻痹，但尚需進一步分子生物學研究證實。

綜上所述，在中國南方漢族人群中發(fā)現(xiàn)GABRA3基因 rs12688628(G/T)位點多態(tài)性與THPP發(fā)病相關，GABRA3基因可能是THPP的易感基因，但這一結論尚需更大的樣本、家系研究來加以驗證。

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