慢性低灌注大鼠血清及腦組織中ICAM－1、NF－κBp65、TNF－α及IL－1β的表達(dá)

王 敏， 曹秉振

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由于各種腦血管病引起的腦功能障礙的后天獲得性智能損害綜合征，其確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。臨床研究發(fā)現(xiàn)VD患者在出現(xiàn)癥狀前2年就存在以額葉、海馬區(qū)為中心的諸多腦區(qū)彌漫性腦血流量下降［1］，而老年癡呆(Alzheimer’s，AD)患者是在癡呆癥狀出現(xiàn)后才開始出現(xiàn)腦血流量的下降［2］。故腦血流量慢性持續(xù)性下降被認(rèn)為是VD的發(fā)病機(jī)制之一。腦缺血后炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)增加，ICAM-1作為內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞之間的重要黏附介質(zhì)，介導(dǎo)了炎性細(xì)胞侵入腦缺血區(qū)，激活的NF-κB通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷等病理生理過程［3］，參與腦缺血損傷的炎癥過程。TNF-α和IL-1-β被認(rèn)為是缺血過程中最主要的炎癥反應(yīng)因子，可能是眾多細(xì)胞因子的重要啟動(dòng)因子，在促進(jìn)腦梗死損傷過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)選用成年雄性Wistar大鼠，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎導(dǎo)致前腦慢性低灌注的動(dòng)物模型，觀察了各組大鼠在缺血后不同時(shí)間段的血清及腦組織中ICAM-1、NF-κBp65、TNF-α和IL-1-β的表達(dá)，探討炎性細(xì)胞因子在慢性低灌注致VD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康Wistar雄性大鼠180只(清潔級(jí)，鼠齡4～5個(gè)月，體重350～450g，由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(魯)2005-0006-0018)。分為正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組和模型組，模型組又分為術(shù)后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m 8個(gè)小組。采用完全隨機(jī)化分組的方法，每組18只大鼠。模型組制作方法:用鹽酸氯胺酮注射液0．2ml/100g腹腔麻醉，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈并分別結(jié)扎動(dòng)脈的遠(yuǎn)近端，從中間剪斷，確保血流被阻斷，術(shù)中大鼠肛溫保持在36．5℃ ～37．5℃，手術(shù)后動(dòng)物被送至通風(fēng)和有空調(diào)的動(dòng)物房飼養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察其行為變化。正常對(duì)照組不做任何處理。假手術(shù)對(duì)照組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余處理與模型組相同。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法 在術(shù)后1d、3d、7d、14d、28d，模型組大鼠每組隨機(jī)取10 只，對(duì)術(shù)后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的程度進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity scores，mNSS)。在術(shù)后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m，模型組大鼠每組隨機(jī)取10只，行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1．2．2 標(biāo)本的采集和固定 在術(shù)后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m，每組隨機(jī)取10 只大鼠，開胸自心尖處取血2ml，室溫下孵育3h，3000r/min離心15min，分離血清，置－70℃，用于ELISA。10只大鼠中隨機(jī)取6只，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水后斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，一側(cè)大腦半球立即置于－70℃冰箱，用于提取RNA;另一側(cè)大腦半球置于冰浴中腦組織勻漿，4℃3000r/min離心15min，取上清，置 －70℃，用于ELISA。10只大鼠中取4只，經(jīng)灌注生理鹽水后用4℃4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于福爾馬林中固定48h后常規(guī)制作石蠟切片。正常對(duì)照組和假手術(shù)對(duì)照組做相同處理。

1．3 組織病理染色 全部切片均行HE、MBP染色。免疫組化染色采用SP法，按照SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作。MBP抗體，日本北海道大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子病理室提供，按1∶2稀釋。NF-κBp65抗體，購(gòu)于NeoMarkers公司，按1∶100稀釋。ICAM-1抗體，TNF-α抗體及IL-1β抗體，武漢博士德生物工程有限公司，按1∶100稀釋。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1．4 光鏡下觀察 以胞漿或胞核染成棕色或棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。不重復(fù)隨機(jī)選取缺血區(qū)海馬10個(gè)視野，高倍鏡(10×40)下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，技術(shù)方法采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)絡(luò)，以“個(gè)/視野”為單位，結(jié)果用±s表示。

1．5 ELISA 按照TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)說(shuō)明書操作。

1．6 RT-PCR 將冰凍的大鼠腦組織按照組織RNA提取試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司)提取總RNA，并用無(wú)RNase的DNase I處理純化。使用Oligo 6．0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京天為時(shí)代科技有限公司合成(見表1)。β-actin為內(nèi)參照。使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司)加入模板和引物，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)GeneAmp PCR System 2400型)進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用2．0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。采用凝膠成像分析儀3UV Transilluminator Model LMS-26E進(jìn)行灰度掃描。用系統(tǒng)所帶軟件Image TRO Plus進(jìn)行灰度掃描和定量分析。NF-KBp65 mRNA及ICAM-1 mRNA水平以PCR產(chǎn)物的灰度與β-actin的灰度之比表示。結(jié)果用±s表示。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2．1 組織學(xué)觀察

2．1．1 HE、MBP染色 見圖1。正常對(duì)照組及假手術(shù)對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常。模型組大鼠缺血后1～3d，海馬區(qū)錐體細(xì)胞缺血水腫呈三角形，核固縮，嗜伊紅，間質(zhì)稀疏呈空泡樣變，CA1區(qū)錐體細(xì)胞及齒狀回細(xì)胞減少;缺血后1m，除上述表現(xiàn)外，腦室周圍白質(zhì)疏松，呈空泡樣變，MBP染色可見髓鞘脫失;缺血后3m，可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要是單核吞噬細(xì)胞，部分炎性細(xì)胞圍繞小靜脈周圍形成袖套樣改變;缺血后3m，皮質(zhì)下白質(zhì)出現(xiàn)多個(gè)軟化灶，白質(zhì)疏松更加明顯，MBP染色示髓鞘脫失明顯。

2．1．2 免疫組化 見圖2、圖3、表2、表3。正常對(duì)照組及假手術(shù)對(duì)照組大鼠有極少量ICAM-1、NF-κB p65表達(dá)。模型組大鼠缺血3d，海馬表達(dá)ICAM-1增加達(dá)到高峰，皮質(zhì)及海馬表達(dá)NF-κB p65增加;缺血1～7d，皮質(zhì)及腦室周圍白質(zhì)TNF-α、IL-1β表達(dá)增強(qiáng)，皮質(zhì)深層、海馬CA1區(qū)明顯增加;缺血7～14d，皮質(zhì)及白質(zhì)表達(dá)ICAM-1、TNF-α、IL-1β 增加，陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，胞漿深染，白質(zhì)及海馬中陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行性增多，缺血7d海馬表達(dá)NF-κB p65達(dá)到高峰;缺血14d后，皮質(zhì)、海馬ICAM-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 表達(dá)則減弱，白質(zhì)愈疏松處陽(yáng)性細(xì)胞大量聚集;缺血2～4m，白質(zhì)廣泛表達(dá)ICAM-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β，皮質(zhì)及海馬區(qū)表達(dá)減少，但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍高于對(duì)照組。

2．2 ELISA測(cè)大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量 見表4。模型組大鼠血清中TNF-α在缺血后7d及1個(gè)月出現(xiàn)兩次高表達(dá)，缺血后7d最高;除缺血后4個(gè)月組與假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組比較P＜0．05，其余組比較P均＜0．01;腦組織勻漿中 TNF-α 在缺血后14d及2個(gè)月出現(xiàn)兩次高表達(dá)，缺血后14d最高，與假手術(shù)對(duì)照組、正常對(duì)照組比較P均＜0．01。

2．3 RT-PCR測(cè)大鼠腦組織勻漿液中ICAM-1、NF-KBp65的含量 見圖4、圖5、表5。經(jīng)灰度掃描分析，模型組大鼠NF-KBp65mRNA在缺血后3d信號(hào)即增加，缺血7d時(shí)最高，明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)對(duì)照組，P＜0．01;隨后逐漸下降，缺血3m時(shí)與對(duì)照組比較仍P＜0．01。ICAM-1mRNA在缺血后3d表達(dá)最高，隨后逐漸下降，缺血3m時(shí)再次升高，除缺血1d組與2m組與正常對(duì)照組和假手術(shù)對(duì)照組比較無(wú)顯著差異外(P＞0．05)，其余組 P 均 ＜0．01。

圖1 ①缺血7d海馬;②缺血1m海馬;③缺血3m白質(zhì);④缺血3m皮質(zhì)血管周圍炎性袖套;⑤缺血2m白質(zhì);⑥缺血4m白質(zhì)

圖2 ①缺血3d海馬;②缺血14d皮質(zhì);③缺血3m白質(zhì);④缺血3d海馬;⑤缺血7d白質(zhì);⑥缺血4m白質(zhì)

圖3 ①缺血14d基底節(jié);②缺血1m視束;③缺血2m白質(zhì);④缺血7d海馬;⑤缺血1m皮質(zhì);⑥缺血3m白質(zhì)

圖4 大鼠腦組織NF-KBp65 mRNA表達(dá)電泳圖

圖5 大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達(dá)電泳圖

表2 慢性腦低灌注大鼠海馬TNF-α和IL-1-β免疫組化表達(dá)(χ ± s ，n=4)

表3 慢性腦低灌注大鼠海馬ICAM-1和NF-κBp65免疫組化表達(dá)(χ ± s ，n=4)

表4 ELISA法測(cè)大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量(±s)

表4 ELISA法測(cè)大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量(±s)

與假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組比較*P＜0．01，與假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組比較#P＜0．05

組別 血清(pg/ml)(n=10) 腦組織(ng/g)(n=6)正常對(duì)照組假手術(shù)組2vo 1d組2vo 3d組2vo 7d組2vo 14d組2vo1m組2vo2m組2vo3m組2vo4m組22．52 ±3．10 23．37 ±3．16 93．15 ±5．71*110．56 ±6．72*138．45 ±7．94*58．10 ±4．19*69．18 ±5．88*48．36 ±4．79*39．24 ±3．40*32．13 ±2．36#39．32 ±1．8340．13 ±1．92 129．45 ±4．38*187．27 ±6．30*234．44 ±7．89*341．96 ±8．47*204．47 ±4．62*295．53 ±6．03*242．78 ±4．48*196．82 ±3．92*

表5 RT-PCR法測(cè)大鼠腦組織ICAM-1 mRNA和NF-κBp65 mRNA 表達(dá)(χ ± s ，n=6)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性低灌注動(dòng)物模型成功。免疫組化、RT-PCR及ELISA的結(jié)果顯示炎性細(xì)胞因子ICAM-1、NF-κBp65、TNF-α、IL-1β 在慢性低灌注的過程中出現(xiàn)慢性持續(xù)性高表達(dá)，其釋放可能在慢性缺血致血管性癡呆的過程中起了一定的作用。Otori等［4］發(fā)現(xiàn)持久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后2d皮質(zhì)腦血流量減少了33%～58%，白質(zhì)和杏仁核的血流量在術(shù)后1w也同樣減少;4w后，腦血流量恢復(fù)，而枕葉皮質(zhì)、白質(zhì)、蒼白球和黑質(zhì)仍處于低灌注狀態(tài)。由此可見此模型造成的腦血流灌注不足的結(jié)果是確切的。這種模型導(dǎo)致的記憶障礙與其它的模型相比，具有慢性、持續(xù)性的特點(diǎn)，從而也證實(shí)了慢性腦灌注不足可導(dǎo)致進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙，是血管性癡呆發(fā)病的主要原因之一。實(shí)驗(yàn)中所觀察到的病理演變過程可分為兩個(gè)階段，早期主要發(fā)生在對(duì)急性缺血缺氧比較敏感的區(qū)域，如額顳葉、視束、海馬和尾殼核，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5］。而一個(gè)月后，白質(zhì)的病變則比較突出，表現(xiàn)為進(jìn)行性髓鞘脫失。大鼠腦新皮質(zhì)、海馬錐體細(xì)胞及紋狀體區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷與學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)［6］，另外本研究所觀察到的白質(zhì)的進(jìn)行性髓鞘脫失可能與慢性低灌注狀態(tài)有關(guān)，這與人類皮質(zhì)下動(dòng)脈硬化導(dǎo)致慢性白質(zhì)病變的機(jī)制可能是一致的。因此慢性前腦缺血大鼠早期出現(xiàn)的缺血敏感區(qū)域的神經(jīng)元的損傷，及后期出現(xiàn)的進(jìn)行性白質(zhì)病變可能是出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙的病理基礎(chǔ)。

TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、NF-κB、缺氧、缺血及再灌注等均可刺激ICAM-1表達(dá)上調(diào)［7］，其機(jī)制可能與炎性細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)的合成與釋放有關(guān)，或由于缺血導(dǎo)致內(nèi)皮下組織因子暴露從而激活凝血酶有關(guān)。在腦缺血/再灌注時(shí)，ICAM-1促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞更加緊密地黏附于血管壁，還可釋放蛋白水解酶、白三烯、血小板激活因子等造成內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷，從而破壞血腦屏障，促進(jìn)腦水腫，加重缺血半暗帶區(qū)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死。急性缺血性腦卒中患者血清中可溶性ICAM-1(sICAM-1)水平在發(fā)病后2～5d明顯增高［8］。大鼠腦缺血后3h皮質(zhì)ICAM-1mRNA表達(dá)明顯增高，6 ～12h 達(dá)到高峰，并持續(xù) 3d［9，10］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化示缺血3個(gè)月時(shí)白質(zhì)中ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行性增多，與RT-PCR的結(jié)果將具有一致性。Fenger等［11］研究認(rèn)為，腦缺血后NF-κB可能激發(fā)了細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程。腦缺血后激活Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使NF-κB快速易位進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)靶基因表達(dá)［12］。激活的NF-κB通過促進(jìn)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞因子、黏附因子、炎性酶類的表達(dá)和氧自由基的形成及鈣超載，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷過程。NF-κB的激活可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)機(jī)制之一，其參與腦缺血炎癥過程的具體機(jī)制尚未完全明確［13，14］?？梢员?NF-κB 上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞因子包括 TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、CD11/CD18 等［15，16］。NF-κB 活化可釋放大量氧化活性物質(zhì)，并產(chǎn)生自由基，加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程［17］。Han 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 的激活可促使一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生自由基，使炎癥反應(yīng)不斷擴(kuò)大。Nurmi等［19］對(duì)大鼠MCAO模型缺血后6h用NF-κB的抑制劑來(lái)治療，發(fā)現(xiàn)腦梗死體積減小了48%。抑制NF-κB后，炎性因子表達(dá)下調(diào)，同時(shí)腦梗死程度減輕［20］。Bhakar等［21］用重組腺病毒封閉轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中內(nèi)源性NF-κB活性會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，而誘導(dǎo)NF-κB的活性可升高抗凋亡蛋白的水平，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。腦缺血損傷后NF-κB的激活對(duì)腦組織具有保護(hù)作用還是損傷作用尚有爭(zhēng)議，關(guān)于NF-κB在缺血性腦損傷中的詳細(xì)作用機(jī)制還需深入探討。

前炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1-β可能是眾多細(xì)胞因子的重要啟動(dòng)因子，可上調(diào)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致局部炎癥的擴(kuò)大，加重腦組織的損傷，TNF-α、IL-1-β可以上調(diào)ICAM-1及NF-κB的表達(dá)［7］。抑制卒中動(dòng)物模型前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)可使腦梗死體積減?。?2］。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α轉(zhuǎn)基因大鼠比正常大鼠表達(dá)大量TNF-α，腦損傷也更嚴(yán)重，說(shuō)明TNF-α在促進(jìn)腦梗死損傷過程中發(fā)揮重要作用［23］。有研究觀察到局灶性腦缺血后1h皮質(zhì)就觀察到TNF-αmRNA的表達(dá)，12h達(dá)高峰，一直持續(xù)到 5d 后［24，25］。還有研究顯示［26］，在腦缺血再灌注0．5h 和1h，TNF-α、IL-1-β 有明顯升高并可持續(xù)至24h，這提示炎性細(xì)胞因子在繼發(fā)性腦損傷中起著非常重要的作用。TNF-α與再灌注中血腦屏障(BBB)通透性的改變密度有關(guān)［27］，應(yīng)用TNF-α抗體可明顯減輕BBB破壞，說(shuō)明TNF-α是BBB通透性指標(biāo)的重要炎性介質(zhì)。IL-1-β是腦缺血早期表達(dá)的促炎因子之一，可促使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，可趨化多形核細(xì)胞在炎癥局部沉積并活化，增加興奮性氨基酸、NO、及自由基等神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。IL-1β還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，加重腦損傷。Caso等［28］用MCAO模型發(fā)現(xiàn)利用抗IL-1β單克隆抗體可降低腦梗死面積。采用IL-1轉(zhuǎn)換酶基因缺陷小鼠研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β對(duì)腦缺血誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)上調(diào)起著重要作用［29］。17β-雌二醇能夠抑制IL-1β所介導(dǎo)的腦內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)和NF-kB活性的增高［30］。此外，TNF-α刺激成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，有助于缺血區(qū)和周圍區(qū)神經(jīng)元存活。另有研究得出IL-1β具有增強(qiáng)神經(jīng)元抗損傷和促進(jìn)修復(fù)的作用。因此，腦缺血后腦內(nèi)TNF-α、IL-1β增加可能具有損傷和修復(fù)雙重作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法可成功建立慢性低灌注的動(dòng)物模型，結(jié)合病理學(xué)及行為學(xué)改變和RT-PCR的檢測(cè)，我們推測(cè)炎性細(xì)胞因子ICAM-1、NF-κBp65的慢性持續(xù)性高表達(dá)可能在慢性缺血致血管性癡呆病理?yè)p傷過程中起了重要的作用。

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