配合物鋅-2，5-噻吩二羧酸-鄰菲啰啉的合成及其與DNA作用的研究

徐 進(jìn)， 姜美平， 武光磊， 高恩軍

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142;

2.沈陽(yáng)市無(wú)機(jī)分子基材料化學(xué)(國(guó)際)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110142)

順鉑是典型的無(wú)機(jī)抗腫瘤藥物，但有較大的毒副作用，為了克服這一不足，科學(xué)家對(duì)其它金屬配合物的藥物前期基礎(chǔ)性進(jìn)行了研究.過(guò)渡金屬配合物在配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)科具有重要的作用，鋅是組裝配位化合物時(shí)常選用的金屬元素，離子易與含N、S配位原子的配體形成配位化合物.過(guò)渡金屬配位化合物的潛在應(yīng)用前景激發(fā)了人們的研究興趣，大量的配位化合物已被制備出來(lái)，其結(jié)構(gòu)和性能已被深入研究.金屬鋅配合物在生命科學(xué)中具有重要作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制活性［1－5］.通常，DNA分子是抗癌化合物作用的主要靶標(biāo)，而光譜學(xué)技術(shù)是研究化合物與DNA作用程度及探討反應(yīng)機(jī)理的重要手段.為進(jìn)一步探討鋅混合配體配合物與DNA作用機(jī)理，我們以2，5-噻吩二羧酸(thca)和鄰菲啰啉(phen)為配體，合成了鋅配合物［Zn(thca)(phen)(H2O)］.借助紫外光譜、熒光光譜和凝膠泳法，研究配合物與DNA的作用規(guī)律，使用本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的Hella細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，得到較為重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker smart 1000 CCD-X射線單晶衍射儀;PHS-3C精密數(shù)顯酸度計(jì);D-MS-I磁力攪拌器;島津 UV2240紫外可見(jiàn)光譜儀;日立23010熒光光譜儀;上海JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀.

氯化鋅、2，5-噻吩二羧酸、鄰菲啰啉均為分析純?cè)噭?HC-DNA從本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的Hella細(xì)胞提取;pBR322 DNA為生化試劑.

1.2 配合物的合成

將10 mL、10 mmol/L的ZnCl2與10 mL、10 mmol/L的2，5-噻吩二羧酸(堿溶)混合，攪拌4 h，將10 mL、10 mmol/L的鄰菲啰啉(醇溶)加入混合溶液，持續(xù)攪拌2 h，然后用0.8 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值為6.42，經(jīng)過(guò)濾得到澄清溶液于小燒杯中，用保鮮膜封口，置于空氣中，經(jīng)過(guò)幾周的溶劑揮發(fā)得到晶體.經(jīng)過(guò)Bruker Smart 1000 CCDC-X射線單晶衍射儀確定了以上所得晶體的結(jié)構(gòu)為［Zn(thca) (phen)H2O］配合物.

1.3 配合物的結(jié)構(gòu)

配合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 配合物配位結(jié)構(gòu)Fig.1 Complexes with structural H atoms are all omitted

配合物晶體結(jié)構(gòu)中主要的鍵長(zhǎng)(nm)如下: Zn(1)—O(1):0.199 06(14);Zn(1)—O(1W): 0.203 62(14);Zn(1)—O(4)#1:0.206 54(14); Zn(1)—N(2):0.209 57(18);Zn(1)—N(1): 0.217 20(17).

配合物晶體結(jié)構(gòu)中主要的鍵角(°)如下: O(1)—Zn(1)—O(1W):128.69(6);O(1)—Zn (1)—O(4)#1:95.17(6);O(1W)—Zn(1)—O (4)#1:88.60(6);O(1)—Zn(1)—N(2): 104.12(6);O(1W)—Zn(1)—N(2):126.92 (6);O(4)#1—Zn(1)—N(2):91.87(6); O(1)—Zn(1)—N(1):95.27(6);O(1W)—Zn(1)—N(1):90.75(6);O(4)#1—Zn(1)—N(1):167.12(6);N(2)—Zn(1)—N(1):78.26 (7).

其他晶體數(shù)據(jù):F(000)=880;R(int)= 0.016 0;Z=4;－12≤h≤13，－18≤k≤17，－13≤l≤10;R1=0.027 1，wR2=0.071 1(I＞2σ(I));R1=0.029 8，wR2=0.072 7(all data).中心鋅離子為五配位，顯現(xiàn)出不規(guī)則四棱錐結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1).為了使得配合物的結(jié)構(gòu)更清晰，H原子全部被省略.

1.4 配合物與HC-DNA作用的光譜測(cè)定

1.4.1 配合物與HC-DNA作用的紫外光譜測(cè)定圖2為一定濃度的配合物(2.0×10－6mol/ L)摻入到不同濃度DNA后的紫外吸收光譜圖.

圖2 配合物與DNA作用的紫外光譜Fig.2 UV spectra of complexes with DNA

配合物在波長(zhǎng)為200～400 nm范圍內(nèi)均有吸收峰.所有這些紫外光譜的最大特征吸收均為芳香氮堿配體內(nèi)的π-π*電子躍遷形成，配合物分子內(nèi)電荷遷移光譜的波長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)，歸屬為MLCT譜［6－8］，其吸收強(qiáng)度較比π-π*弱.DNA的摻入使配合物各特征吸收峰在波長(zhǎng)發(fā)生紅移的同時(shí)，發(fā)生明顯的減色效應(yīng)，DNA濃度越大，則上述趨勢(shì)越明顯.這是由于配合物以插入方式與DNA螺旋堿基對(duì)結(jié)合，發(fā)生的π電子堆砌作用，使其配體上π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，能級(jí)下降，從而導(dǎo)致π-π*躍遷能減小，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象;同時(shí)，偶合后的π軌道因部分填充電子，使 π-π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)［9］.

1.4.2 配合物與HC-DNA作用的熒光光譜測(cè)定

溴化乙錠(EB)具有共軛芳香環(huán)的平面結(jié)構(gòu)，能專一平行地嵌入DNA雙鏈的配對(duì)堿基之間.在水溶液中，其本身熒光極弱，而DNA分子幾乎沒(méi)有熒光.但當(dāng)溴化乙錠插入雙鏈DNA分子之后，溴化乙錠分子借助其與堿基之間的堆積作用而能平行地“固定”在DNA分子內(nèi)部，從而使溴化乙錠分子平面剛性增加，碰撞淬滅減小，發(fā)出的熒光強(qiáng)度約提高10倍［10］.溴化乙錠不能插入單鏈DNA中，而只能插入雙螺旋DNA分子中.因?yàn)樗cDNA的插入作用是通過(guò)堿基間堆積而產(chǎn)生的.因而，溴化乙錠是一種能與DNA雙鏈發(fā)生專一插入作用，且選擇性好，靈敏度高的熒光探針.

溴化乙錠(EB)插入DNA后使DNA原來(lái)的緊密螺旋松弛，阻礙了DNA的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄復(fù)制，進(jìn)而影響生物體的繁殖.如果所合成的藥物(M)與EB的結(jié)構(gòu)相似且本身熒光很弱，就能與DNA發(fā)生類似EB的插入作用，而競(jìng)爭(zhēng)EB與DNA結(jié)合的位點(diǎn)，釋放出EB，使EB/DNA復(fù)合體系熒光減弱:M+EB·DNA=M·DNA+EB.同時(shí)可通過(guò)跟蹤此體系的熒光變化來(lái)說(shuō)明藥物(M)與DNA結(jié)合能力的強(qiáng)弱.根據(jù)經(jīng)典的斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程［11］可說(shuō)明藥物對(duì)DNA插入作用的強(qiáng)弱.

其中:I和 I0分別代表復(fù)合物(配合物/EB/ DNA)中存在和不存在配合物時(shí)的熒光強(qiáng)度;r為復(fù)合物中配合物與DNA的濃度比;Ksq表示斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)淬滅常數(shù)，其可以定量描述配合物與DNA作用的強(qiáng)弱.從Ksq值的大小就可以定量地比較幾個(gè)化合物在相同條件下與DNA作用的強(qiáng)弱程度，Ksq值越大，作用強(qiáng)度越大，結(jié)合能力越強(qiáng).

通過(guò)熒光法測(cè)定配合物與自提HC-DNA發(fā)生相互作用的結(jié)果見(jiàn)圖3及圖4.

從圖4中可以看出配合物的淬滅常數(shù)Ksq= 0.203，對(duì)HC-DNA具有一定的插入能力;從圖3中可以看出:隨著配合物濃度的增加，DNA-EB復(fù)合物的體系熒光強(qiáng)度均逐漸減弱，且發(fā)生了不同程度的淬滅，并且濃度越大，熒光猝滅逐漸趨于平衡.

圖3 不同濃度的配合物與DNA作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of the complexes with DNA

圖4 配合物與DNA-EB體系作用的淬滅常數(shù)(0.203)Fig.4 Interaction with the DNA-EB system，the role of the quenching constant(0.203)

1.5 凝膠電泳法研究鋅配合物對(duì)pBR322-DNA的切割作用

在外電場(chǎng)的作用下，帶電荷物質(zhì)會(huì)向著與其所帶電荷電性相反的電極移動(dòng).DNA中存在有親水性的磷酸基團(tuán)，在高于其等電點(diǎn)的緩沖溶液中帶負(fù)電荷，可使DNA在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極泳動(dòng);影響DNA在凝膠介質(zhì)中移動(dòng)的因素主要有電荷效應(yīng)、凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng).在電荷相同的條件下，凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)至關(guān)重要，其與分子量大小及構(gòu)型有關(guān);分子量越小，空間構(gòu)型產(chǎn)生的空間位阻越小，遷移位置就越靠前，而DNA帶間的距離也就越大.如pBR質(zhì)粒DNA存在共價(jià)閉環(huán)(ccc)、單鏈開(kāi)環(huán)(oc)和線性(linear)三種空間構(gòu)型;由于ccc分子結(jié)構(gòu)最為緊密，oc分子結(jié)構(gòu)最為松弛，因而在一般情況下，ccc在最前，oc在最后，而linear介于二者之間.當(dāng)共價(jià)閉環(huán)型(ccc)DNA的一條鏈上出現(xiàn)一個(gè)缺口(nick)時(shí)，超螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，形成開(kāi)環(huán)型(oc)結(jié)構(gòu).若兩條鏈在同一位置發(fā)生斷裂時(shí)，則成為線形分子(linear).某些能插入DNA雙螺旋堿基對(duì)之間的試劑，如EtBr、放線菌素D，可以改變DNA的超螺旋狀態(tài)，使負(fù)超螺旋減少，以至完全松開(kāi)形成oc甚至形成正超螺旋，進(jìn)而能通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出來(lái)［12－13］.本文基于上述原理及前面的熒光法實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以凝膠電泳實(shí)驗(yàn)來(lái)研究配合物對(duì)DNA的切割作用.

圖5是配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果.Lane 0是純的pBR322-DNA alone，Lane 1～4為4個(gè)不同濃度配合物與DNA在有氧的條件下反應(yīng)1 h的電泳圖像.配合物的4個(gè)不同濃度1、2、3、4分別是 5.0 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L、0.625 μmol/L.從圖5可以看出:隨著化合物的濃度的增加，F(xiàn)ormⅠ在逐漸地減少，F(xiàn)ormⅡ也在逐漸地減小，并且FormⅠ、FormⅡ都比Lane0要小.此現(xiàn)象表明了這些配合物對(duì)pBR322-DNA具有一定的切割能力.鋅配合物對(duì)pBR322-DNA的切割，再次證明了配合物是以專一的插入方式與DNA發(fā)生作用的.

圖5 配合物對(duì)pBR322-DNA的切割電泳圖Fig.5 Electrophoresis of pBR322-DNA cutting via complexes

1.6 鋅配合物對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的研究

對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，讓其在蓋玻片上面爬行生長(zhǎng).經(jīng)濃度為5 μmol/L順鉑作用，配合物處理24 h后，取出蓋玻片，經(jīng)PBS輕輕漂洗后，用乙醇在常溫下固定5～10 min，即可染色，固定(fication)的目的是保持細(xì)胞自然形態(tài)，防止細(xì)胞自溶和細(xì)菌所致的腐敗;固定液能沉淀和凝固細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破壞細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶，使細(xì)胞不但保持自然形態(tài)，而且結(jié)構(gòu)清晰，易于著色.著色過(guò)程如下:蘇木精液染5～15 min→流水稍洗去蘇木精液1 min→鹽酸乙醇分化30 s→稍水洗10～30 s→促藍(lán)液返藍(lán)10～30 s→流水沖洗10～15 min→蒸餾水過(guò)洗1～2 s→伊紅液染色2 min→蒸餾水稍洗1～2 s→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(Ⅰ)1 min→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(Ⅱ)1 min→無(wú)水乙醇1 min.

細(xì)胞凋亡［14－17］又稱細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程.細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死，是程序性死亡過(guò)程的一種主要形式，強(qiáng)調(diào)的是形態(tài)學(xué)上的改變.細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的簡(jiǎn)單區(qū)別見(jiàn)表1.

表1 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的簡(jiǎn)單區(qū)別Table 1 The simple difference between apoptosis and necrosis

將處理好的爬片放在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照.從圖6(a)中可以看出:正常HeLa細(xì)胞在染色后呈不規(guī)則的多角形，細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核完整，染色體均勻淡藍(lán)色，屬正常生長(zhǎng)狀態(tài).圖6(b)是順鉑作用后HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，變小，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，集聚至核周邊呈月牙形斑塊，胞核深染，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有出芽現(xiàn)象，并伴有凋亡小體.配合物作用過(guò)的細(xì)胞也發(fā)生了類似的變化，如圖6(c)，可明顯地觀察到凋亡的形態(tài)學(xué)特征.由此看出，HeLa細(xì)胞在配合物的作用下發(fā)生了不同程度上的凋亡.

圖6 染色后HeLa細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)Fig.6 The shape of the staining of HeLa cells under the microscope

2 結(jié)束語(yǔ)

采用常溫溶劑揮發(fā)的方法合成了1個(gè)鋅(Ⅱ)配合物，分子式為［Zn(thca)(phen) (H2O)］(其中thca:2，5-噻吩二羧酸，phen:鄰菲啰啉).用X-射線單晶衍射技術(shù)測(cè)定了配合物的晶體結(jié)構(gòu)單元.配合物與HC-DNA作用的紫外光譜研究表明:配合物在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有明顯的特征吸收峰，表現(xiàn)為分子內(nèi)π-π*電子越遷.加入HC-DNA后，配合物的紫外光譜均發(fā)生減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，說(shuō)明配合物能與HC-DNA發(fā)生嵌插作用.配合物與HC-DNA作用的熒光光譜研究表明:DNA/EtBr復(fù)合物中加入配合物后，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，這說(shuō)明配合物能與溴化乙錠競(jìng)爭(zhēng)插入DNA堿基對(duì)中.配合物電泳實(shí)驗(yàn)表明:配合物對(duì)pBR322-DNA具有一定的切割能力.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:配合物對(duì)HeLa細(xì)胞有一定的殺傷能力，對(duì)HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.

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