大黃素與心血管疾病

李永貴 李強(qiáng)翔 (南華大學(xué)附屬婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 47000)

大黃素(Emodin)(1，3，8-三輕基-6-甲基蒽醌)是天然蒽醌化合物，別名為朱砂蓮甲素，分子式是 C15H10O5，分子量：270.23，CAS號：518-82-1，來源于蓼科植物虎杖的干燥根莖和根。掌葉大黃的根莖。規(guī)格有50%，80%，98%。大黃素可用作瀉藥，雖有瀉下活性，但由于體內(nèi)易被氧化破壞，實(shí)際上瀉下作用很弱，如與糖結(jié)合成苷類，則可發(fā)揮瀉下作用。近來研究〔1〕證實(shí)它具有抑菌、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及清除氧自由基、抗缺血、抑制血管平滑肌增殖、對心肌細(xì)胞內(nèi)鈣及L-型鈣電流具有雙向調(diào)節(jié)、保護(hù)肝腎及胃腸道、抗癌等一系列保護(hù)作用。

1 大黃素對急性心肌梗死(AMI)的治療作用

1.1 AMI是指冠狀動脈急性閉塞導(dǎo)致部分心肌缺血壞死的過程，是臨床常見的心血管疾病和危急重癥，它是目前心腦血管疾病的主要死因之一。AMI存在炎癥現(xiàn)象，炎性細(xì)胞因子在其中扮演重要的角色，它們不僅促進(jìn)AMI始動因素-冠脈粥樣硬化斑塊的形成、破裂，而且對AMI發(fā)生后的病理生理過程和預(yù)后有重要影響。AMI患者急性期血清或血漿中的腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等促炎細(xì)胞因子高于正常人，且其水平與心功能分級有密切關(guān)系。如金哲秀等〔2〕探討了TNF-α與AMI患者心功能 Killip分級的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) AMI患者血清TNF-α水平不僅顯著高于正常人，而且隨心功能Killip分級而呈遞增趨勢，尤其Killip4級的AMI患者增高更顯著?？讖?qiáng)等〔3〕發(fā)現(xiàn)AMI大鼠的心肌組織TNF-α基因和蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。至于AMI患者急性期血清中升高的促炎細(xì)胞因子的主要來源，一般認(rèn)為源于心肌釋放。如有學(xué)者〔4〕認(rèn)為AMI患者血清TNF-α水平升高，是因心肌梗死面積較大時(shí)，心肌局部產(chǎn)生的TNF-α達(dá)到足夠多而溢出進(jìn)入血液循環(huán)所致?；谶@些新的認(rèn)識，提出了對AMI進(jìn)行抗感染治療的設(shè)想，相關(guān)研究已初證實(shí)抗感染治療對AMI有益。這有望成為治療AMI的新方法。AMI抗炎藥物的研發(fā)，國外研究主要集中在細(xì)胞因子受體拮抗劑和抗細(xì)胞因子抗體，但其價(jià)格高昂且有一定的副作用。而我國中藥資源豐富而且價(jià)格低廉，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明大黃素具有較好的抗炎〔5〕、抗缺血缺氧〔6〕等效應(yīng)，并且對培養(yǎng)的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用〔7〕。通過結(jié)扎冠狀動脈建立AMI小鼠模型，應(yīng)用大黃素進(jìn)行干預(yù)性的治療，觀察到大黃素對AMI具有改善心功能，減少心肌梗死面積的保護(hù)作用。并且能夠下調(diào)心肌組織TNF-α、IL-6水平及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)，可能是其保護(hù)AMI的重要機(jī)制之一。

2 大黃素對血管的影響

2.1 大黃素對血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的作用途徑 許多心血管疾病〔如動脈粥樣硬化，高血壓，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)后再狹窄〕的發(fā)生均有VSMC的參與。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞增殖信號作用于細(xì)胞膜或胞質(zhì)受體并經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞進(jìn)而影響細(xì)胞周期的結(jié)果，細(xì)胞周期時(shí)相的改變是影響細(xì)胞增殖的重要原因。VSMC的增殖也不例外〔8〕。

細(xì)胞周期調(diào)控蛋白包括細(xì)胞周期素(cyclin)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)等。cyclin為參與細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)家族，是CDK的活性輔助因子。Cyclin D在細(xì)胞周期中最早被合成，于G1中期達(dá)高峰，多與CDK4/CDK6組成合酶發(fā)揮作用。Cyclin D1是VSMC主要的D型 cyclin〔9〕，cyclinD1/CDK 合酶活性在G1早期至中期達(dá)最高，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。眾所周知，細(xì)胞增殖主要取決于DNA的合成。對于同一細(xì)胞群來說，G0/G1期細(xì)胞所占比例越低，S期細(xì)胞所占比例越高，該群細(xì)胞增殖越活躍。大黃素能使cyclinD1表達(dá)受到抑制、表達(dá)量下調(diào)，影響與CDK形成合酶，細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生改變，從而阻滯細(xì)胞周期G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力下降。同時(shí)Lukas等〔10〕發(fā)現(xiàn)cyclinDl在癌細(xì)胞中有異常高表達(dá)，將cydlinD1抗體引人細(xì)胞可減弱腫瘤細(xì)胞的增殖能力。大黃素下調(diào)cyclinD1表達(dá)，究其原因可能與影響細(xì)胞增殖相關(guān)的信號傳遞系統(tǒng)酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)等相關(guān)〔11，12〕。大黃素還可能通過抑制SMC癌基因表達(dá)而影響細(xì)胞增殖。因?yàn)槟壳耙延袌?bào)道SMC受到有絲分裂因子刺激或表型轉(zhuǎn)換過程中，C-fos、C-myb、C-myc癌基因表達(dá)增高，C-fos癌基因可使細(xì)胞由G0到G1期，而C-myc在細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化時(shí)表達(dá)增高〔13〕。

血管緊張素(Ang)Ⅱ是一種重要的血管活性物質(zhì)，可以自分泌和旁分泌的方式作用于VSMC，促進(jìn)其增殖〔14〕。一氧化氮(NO)是抑制VSMC增殖的-種重要調(diào)節(jié)因子〔15〕，主要由NOS催化L-精氨酸生成。NOS是NO合成的限速酶，對NO的生成具有重要的影響〔16〕，它主要有神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘生型(iNOS)3種。iNOS在基礎(chǔ)狀態(tài)表達(dá)很低，但在各種刺激因素作用下表達(dá)及激活，增加NO的產(chǎn)生，故NO可以通過抑制VSMC增殖及遷移〔17，18〕等影響心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。AngⅡ和NO相互作用，影響VSMC增殖，兩者之間失去平衡可能是某些心血管疾病發(fā)生發(fā)展的原因〔19〕。大黃素在10～80 μmol/L能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖，它可升高培養(yǎng)液中iNOS水平，并上調(diào)培養(yǎng)細(xì)胞中iNOSmRNA的表達(dá)，說明大黃素通過增加細(xì)胞iNOSmRNA表達(dá)，從而升高iNOS水平，進(jìn)一步升高NOS水平，并通過增加NO水平來發(fā)揮抗增殖作用。因此大黃素對AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌增殖可能是通過NO信號通路發(fā)揮作用。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是1978年用免疫熒光方法鑒定出在細(xì)胞增殖期出現(xiàn)的核蛋白，相對分子質(zhì)量為3.6×106，又稱細(xì)胞周期蛋白、DNA聚合酶δ輔助因子，PCNA在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期運(yùn)行中作用巨大，其合成與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，在靜息狀態(tài)細(xì)胞PCNA合成極低，在血清刺激后增高6～7倍。純化后生長因子(如血小板衍生生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子)可誘導(dǎo)PCNA的合成，因而PCNA是-個(gè)動物細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因〔20〕，大黃素能抑制VSMC PCNA的表達(dá)，說明大黃素可抑制細(xì)胞增殖PCNA基因產(chǎn)物。用了大黃素以后，平滑肌細(xì)胞的PCNA抗體染色呈陰性，說明PCNA蛋白表達(dá)受到抑制。大黃素抑制PCNA蛋白的表達(dá)，使DNA不能復(fù)制，細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的G0期。大黃素的這種抑制作用可能是直接作用于PCNA蛋白表達(dá)水平，亦可能作用于生長因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)水平上，或多個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。PCNA可以看作影響SMC增殖的多種因素作用的最后的共同通路。因此可以說阻抑PCNA蛋白的表達(dá)是大黃素抑制SMC增殖的重要機(jī)制之一。

大黃素通過NADPH氧化酶促進(jìn)活性氧簇(ROS)產(chǎn)生。ROS途徑是大黃素促細(xì)胞凋亡效應(yīng)的重要途徑之一。ROS是一組具有高度活性的化學(xué)物質(zhì)，包括超氧陰離子、氧自由基、過氧化氫等。細(xì)胞內(nèi)ROS生成途徑眾多，主要有線粒體、內(nèi)源性酶類(NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂加氧酶、環(huán)氧化酶)、非線粒體細(xì)胞器(CYP-細(xì)胞色素p450氧化酶)，目前研究已經(jīng)證實(shí)低濃度大黃素抑制細(xì)胞增殖，高濃度大黃素促進(jìn)細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡有兩種方式：壞死和凋亡。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的最終結(jié)果極為相似，但是它們的過程卻有極大的差別〔21～23〕。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的主動性細(xì)胞自殺過程，是有序變化的死亡過程。細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。大黃素既可以促進(jìn)細(xì)胞的壞死，也可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，以凋亡為主。大黃素還可以通過損傷DNA，啟動p53途徑，無論是抑制細(xì)胞生長還是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在大黃素抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)中均占有重要地位。p53蛋白是細(xì)胞對多種致突變應(yīng)激的反應(yīng)產(chǎn)物，如DNA損傷、異常增殖過程，激活后可以迅速抑制細(xì)胞生長。對于DNA損傷而言，輕微的損傷促使低濃度的p53表達(dá)，細(xì)胞生長停止，等待自身的修復(fù)。如果能夠完成修復(fù)，細(xì)胞可以進(jìn)行增殖活動;如果不能完成修復(fù)或者p53表達(dá)過高將導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，整個(gè)過程主要取決于細(xì)胞類型和具體環(huán)境〔24～26〕。結(jié)果表明，大黃素能夠迅速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，少量分布于細(xì)胞核中。隨著大黃素濃度的升高，許多DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)均增強(qiáng)，如：ATM、DDBI、ERCC1、ERCC5、RAD50等。p53蛋白表達(dá)水平與大黃素濃度呈明顯的正相關(guān)，大黃素可以抑制多種蛋白激酶〔27，28〕，如酪氨酸激酶 P56Ick、PKA、PKC、cdc2、CKⅠ和 CKⅡ等，動力學(xué)研究結(jié)果表明大黃素是ATP的競爭性抑制劑。已有實(shí)驗(yàn)〔29〕證實(shí)大黃素還可以抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)。TopⅡ?qū)τ诩?xì)胞染色體的穩(wěn)定性至關(guān)重要，它的功能受到抑制必將產(chǎn)生DNA損傷。細(xì)胞核內(nèi)的大黃素可能是通過競爭性抑制TopⅡ活性從而產(chǎn)生DNA損傷，進(jìn)而啟動p53途徑。綜上所述，低濃度大黃素抑制細(xì)胞生長，高濃度大黃素促進(jìn)細(xì)胞死亡，以凋亡為主。ROS途徑和p53途徑是大黃素發(fā)揮效應(yīng)的兩個(gè)主要的、獨(dú)立的途徑。低濃度大黃素可能以p53途徑為主，高濃度則可能以ROS途徑為主。大黃素還可能通過p53途徑促進(jìn)細(xì)胞老化，可能通過ROS途徑促進(jìn)細(xì)胞自噬。

大黃素通過上述機(jī)制可以使VSMC增殖得到抑制，并促進(jìn)其凋亡，對血管具有保護(hù)作用。

2.2 大黃素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用 正常的內(nèi)皮細(xì)胞是-層連續(xù)覆蓋于整個(gè)血管腔表面的扁平細(xì)胞，具有許多重要的生理功能，它在血液和組織之間構(gòu)成通透性屏障，能主動攝取和降解血液中的一些小分子物質(zhì)，包括5-羥色胺、活化的補(bǔ)體等，對限制炎癥反應(yīng)有重要意義;它有抗血栓功能，可防止血液成分與內(nèi)皮下組織相互作用，防止血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和血栓形成。內(nèi)皮細(xì)胞是一種活躍的內(nèi)分泌器官，可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)如一氧化氮、前列腺素2、內(nèi)皮素、AngⅡ及成纖維母細(xì)胞生長因子等，從而調(diào)節(jié)血管的張力和血管平滑肌細(xì)胞生長。生理狀態(tài)下，各種收縮(促)生長因子與擴(kuò)張(抑)生長因子處于平衡狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整是維持內(nèi)皮正常功能的前提〔30〕。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能失調(diào)時(shí)，平衡被打破，導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板黏附，血栓形成和VSMC異常增生〔31〕。血管內(nèi)皮的完整和血管內(nèi)皮功能的正常不僅對預(yù)防動脈硬化斑塊的形成具有極其重要的作用，也對預(yù)防冠狀動脈內(nèi)介入治療后再狹窄的發(fā)生具有至關(guān)重要的作用。通過大黃素對體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)干預(yù)和影響的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的大黃素作用HUVEC 24 h和48 h，對細(xì)胞增殖活性無顯著影響，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20、40、80 μmol/L大黃素作用72 h，能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，與正常組比較有顯著差異(P＜0.05)。提示大黃素有可能具有抑制HUVEC的增殖作用。但是對內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用的程度及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

大黃素還可以通過非內(nèi)皮依賴性方式和內(nèi)皮依賴性二種方式舒張血管，通過對內(nèi)皮依賴性的舒張機(jī)制可能是通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞NO/cGMP信號途徑來實(shí)現(xiàn)的。NO/cGMP信號途徑在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力過程中扮演-個(gè)重要的角色，一些舒血管物質(zhì)，如(ACh)，主要是通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NOS的活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO。一方面，NO作用于可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，引起cGMP的升高，導(dǎo)致血管舒張〔5〕。另一方面，由于NO可通過直接激活四乙胺(TEA)敏感型鉀通道而發(fā)揮舒血管作用〔6〕。大黃素對苯腎上腺素(PE)及KCl誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮大鼠胸主動脈環(huán)具有濃度依賴性的舒張作用，一氧化氮合酶(NOS)制劑L-NAME和鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ處理能顯著抑制大黃素對內(nèi)皮完整血管的舒張作用，提示大黃素通過內(nèi)皮依賴性方式和非內(nèi)皮依賴性兩種方式舒張血管，并與內(nèi)皮中NOS的活性相關(guān)。40 μmol/L大黃素可顯著升高血管iNOS(誘導(dǎo)型-氧化氮合酶)的活性，對cNOS(結(jié)構(gòu)型-氧化氮合酶)的活性影響不顯著。從而推測大黃素通過增強(qiáng)iNOS的活性，升高了NO和下游信號分子cGMP的水平而舒張血管。

3 大黃素與動脈粥樣硬化(AS)

AS發(fā)生的機(jī)制至今仍未十分清楚，一般認(rèn)為和脂質(zhì)代謝障礙有密切關(guān)系〔32，33〕。高脂血癥是AS的易患因素，它主要通過對脂蛋白的氧化作用促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展，如單核細(xì)胞浸潤、血小板黏附聚集、刺激VSMC向血管內(nèi)膜遷移與增殖、巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)而形成泡沫細(xì)胞。脂質(zhì)的不斷沉積和平滑肌細(xì)胞的持續(xù)增生，并經(jīng)過一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)和惡性循環(huán)而形成AS。具有抗氧化和清除氧自由基的作用。大黃素對AS的防治作用機(jī)制可能是與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。它對AS形成的抑制作用在一定范圍內(nèi)隨劑量的增大而作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，以80 mg/kg劑量作用最佳，不但使血清三酰甘油和總膽固醇水平降低，高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇升高，而且病理形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)動脈內(nèi)膜水腫消失。因此，大黃素有調(diào)血脂和抗AS作用。

另外有研究報(bào)告大黃素可以使小鼠AS斑塊中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)降低，其內(nèi)源性的抑制因子組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1表達(dá)升高。MMPs是-類鋅離子和鈣離子依賴性蛋白水解酶家族，作用是特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)成分相結(jié)合并降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種組成成分，削弱AS斑塊纖維帽的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)斑塊破裂和血栓形成，最終導(dǎo)致 ACS。MMP-2和MMP-9是AS斑塊中MMPs的主要成分，與AS斑塊穩(wěn)定性關(guān)系密切〔34〕。大黃素可以通過下調(diào)斑塊中 MMP-2、MMP-9的表達(dá)，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，在一定程度上改變斑塊的組織學(xué)構(gòu)成，發(fā)揮穩(wěn)定AS斑塊的作用，對于防治急性心血管臨床事件具有積極意義。

4 大黃素與藥物洗脫支架

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃素能夠抑制VSMC的遷移和增殖，是支架涂層藥物的可選藥物〔35〕。由于支架上所載的藥量非常有限，在長時(shí)間的緩慢釋放過程中能否在局部維持穩(wěn)定濃度對于其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的效果至關(guān)重要。雖然藥物主要在肝臟中進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，但是不排除肝外組織對藥物的代謝作用，因此，藥物在局部的代謝轉(zhuǎn)化速度也是選擇支架涂層藥物所需要考慮的問題。大黃素在代謝時(shí)具有以下特點(diǎn)：(1)誘導(dǎo)代謝酶(CYP)表達(dá)〔36〕;(2)某些代謝衍生物具有生物學(xué)活性〔37〕;(3)在代謝過程中伴隨有一定比例的ROS生成。通過實(shí)驗(yàn)研究我們得出大黃素在VSMC中并不存在代謝轉(zhuǎn)化。大黃素在VSMC作用24 h后上清液中濃度沒有顯著降低就是VSMC無法代謝大黃素最為直接的證據(jù)。并且國內(nèi)已有學(xué)者〔38〕采用具有專利技術(shù)的生物可降解肝素化嗎啉二酮芐酯與L-丙交酯的共聚物材料，大黃素作為藥物，在自制的計(jì)算機(jī)控制的噴涂設(shè)備上成功制備了大黃素藥物洗脫支架〔藥物含量(150±5)μg〕。在豬的體內(nèi)與裸支架和不含藥的聚合物涂層支架進(jìn)行了1個(gè)月和3個(gè)月的對照實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，所制備的藥物支架擴(kuò)張后表面無撕裂、掛膜。此外，高含量比的藥物支架(大黃素含量50%)中的藥物10 d內(nèi)的釋放達(dá)到90%。3個(gè)月后體內(nèi)涂層材料大部分發(fā)生降解，從血管切片和內(nèi)膜厚度可以看出，大黃素對內(nèi)膜增生有著明顯的作用，可以抑制血管內(nèi)的再狹窄。

總之，大黃素在心血管方面具有保護(hù) AMI細(xì)胞，抑制VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，通過非內(nèi)皮依賴性方式和內(nèi)皮依賴性二種方式舒張血管，穩(wěn)定AS斑塊，及制作藥物洗脫支架的作用，為心血管疾病提供新的治療方案。但就目前所知，大黃素對心血管的上述作用機(jī)制還沒有完全了解透徹，有待于進(jìn)一步的研究。

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