果膠酶法提取番茄總皂苷的工藝研究

陳思呈，劉金磊，盧鳳來，李典鵬*

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林541006;2.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541004)

番茄Lycopersicon esculentum Mill.為茄科番茄屬植物，原產(chǎn)南美洲，我國各地均普遍栽培。番茄皂苷為番茄中水溶性成分，而番茄紅素為番茄中脂溶性成分，在加工生產(chǎn)番茄紅素過程中，往往需要脫水而將番茄皂苷白白損失浪費掉。目前國內(nèi)還很少有番茄皂苷的研究報道，日本的研究人員在番茄皂苷的理化性質(zhì)及藥理活性方面進行了深入而廣泛的研究，并證明番茄皂苷尤其是主要成分番茄皂苷A(esculeoside A)具有多種生理和藥理活性，其在降血脂及抗動脈粥樣硬化方面具有獨特的作用［1-2］。

目前國內(nèi)外尚未見番茄皂苷提取工藝的研究報道。選用適當?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧?，破壞細胞壁的致密構造，有利于有效成分的溶出，以提高目標物質(zhì)的得率［3］。果膠酶(pectinase)是能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱［4］，果膠酶作用于果膠質(zhì)中D-半乳糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，使高分子的聚半乳糖醛酸降為小分子物質(zhì)［5］。本實驗首次建立了番茄總皂苷果膠酶酶解的工藝，為進一步研究番茄皂苷提供了依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 實驗儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(美國Alltech公司);安捷倫化學工作站(美國Agilent公司);R-3旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司);TL-5.0臺式離心機(上海市離心機械研究所);TP-2200B電子天平(湘儀天平儀器設備有限公司);METTLER AT200分析天平(上海涵今儀器儀表有限公司);B3500S-MT超聲清洗器(必能信超聲有限公司);L-550離心機(湘儀離心機儀器有限公司);Christ Alpha 1-2實驗室高級凍干機(德國Martin Christ公司);MILLIPORE Simplicity超純水器(上海人和科學儀器有限公司);果汁機(九陽股份有限公司)。

1.2 實驗材料新鮮成熟櫻桃小番茄，購自桂林資源縣番茄種植基地;自制番茄皂苷A標準品(經(jīng)核磁共振譜1HNMR，13C-NMR鑒定其結構，HPLC-ELSD法測定得出純度為98.9%)。

1.3 化學試劑果膠酶(型號:PP-3，天津利華酶制劑技術有限公司);甲醇(美國TEDIA公司，色譜純);重蒸蒸餾水(自制);超純水(自制);去離子水(自制)。

2 方法與結果

2.1 番茄皂苷A的測定番茄皂苷A在HPLC-ELSD檢測法中顯示其相對含有量占總皂苷的很大的部分，其它皂苷類物質(zhì)則含有量很低［6］，因此后續(xù)大部分工藝環(huán)節(jié)主要以番茄皂苷A為考察指標。同一批次番茄打漿酶解后直接通過測定番茄皂苷A的濃度來評價工藝參數(shù)，可以減少過多的后續(xù)操作帶來計算結果上的誤差。番茄中的皂苷主要為甾體皂苷，而由于甾體皂苷具有無紫外吸收或吸收極弱的特點，其檢測存在很大的困難［7］，目前據(jù)文獻報道的、蒸發(fā)光散射檢測已經(jīng)成功地應用于酸棗仁皂苷、人參皂苷、黃芪皂苷等的定量分析與檢測［8］。因此對其測定方法及條件進行了研究。

2.1.1 番茄皂苷A標準品的配制精密稱取10.00 mg番茄皂苷A標準品，用50%甲醇水溶液(在此濃度的溶劑中有最好的溶解度)定容到50 mL，配置成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，即0.2 μg/μL的番茄皂苷A標準品溶液。

2.1.2 色譜條件的確立色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇-水(梯度洗脫:0→5 min:20%→40%甲醇;5→10 min:40%→60%甲醇;10→20 min:60%→80%甲醇);檢測時間:20 min;后運行時間:5min;流動相體積流量:0.8 mL/min;ELSD檢測器參數(shù):漂移管溫度:100℃?？諝?2.7L/min。見圖1。

圖1 對照品和樣品的HPLC色譜圖

2.1.3 標準曲線的制備依次精密吸取0.6、1.2、1.8、2.4、3.6、4.2 μg的標準品溶液，以進樣量(μg)的常用對數(shù)值為橫坐標，峰面積積分值的常用對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。回歸方程為:Y=1.697 4X+5.717 3，R2=0.999 6。番茄皂苷A在0.6～4.2 μg范圍內(nèi)有良好的線性關系。

2.1.4 精密度實驗標準品溶液連續(xù)進樣6次，每次15 μL，記錄峰面積，計算峰面積及相當于番茄皂苷A質(zhì)量的RSD值，其中峰面積RSD為1.01%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為0.61%，結果表明，儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗精密稱取粗皂苷粉末102.00 mg，定容至50 mL，0～10 h分別檢測，記錄峰面積，計算峰面積及質(zhì)量的RSD值。其中峰面積RSD為2.95%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為1.73%，結果表明，供試樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復性實驗精密稱取6份粗皂苷粉末，每份100 mg，定容至50 mL，檢測并記錄峰面積，計算峰面積及質(zhì)量的RSD值。其中峰面積RSD為2.17%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為1.31%，結果表明，供試樣品重復性良好。

2.1.7 加樣回收率實驗精密稱取4份測定過番茄皂苷A含有量的粗皂苷粉末，每份約100 mg。精密稱取番茄皂苷A標準品4份，每份2 mg，分別加到4份樣品中，最后定容到50 mL。檢測峰面積，求算回收率、平均回收率和RSD值。平均回收率為96.03%，RSD為0.41%，結果表明實驗方法準確度較高，符合測定要求。

2.2 酶解單因素實驗

2.2.1 酶添加量對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱量9份，每份1 kg，放入燒杯中，分別加入相當于鮮果質(zhì)量0.0、0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、0.6‰、0.7‰、0.8‰的果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2.0 h，立即取出離心，液相檢測其中番茄皂苷A的峰面積，計算其質(zhì)量濃度，平行2份，結果取平均值。由圖2可知，隨著添加酶量的增加，開始時清液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度逐漸升高，超過0.5‰后逐漸下降。有文獻報道果膠酶制取總皂苷相關工藝，分析其中的原因可能是，當繼續(xù)加大酶量，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制，造成皂苷得率下降［9-10］，孟碩等實驗證明單一果膠酶對苷鍵亦有一定的水解作用［11］。實驗用的果膠酶，其中可能存在一些競爭性抑制因子，則會抑制果膠酶與底物的結合，雜質(zhì)糖苷酶的存在也會造成皂苷類物質(zhì)糖苷鍵的水解。但是一定量果膠酶的加入，增加了番茄漿的澄清度和可過濾性，使得后續(xù)的離心及過柱更簡便易行［12］，因此選定最佳酶加入量為0.4‰。

圖2 酶添加量對番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.2 酶解反應溫度對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在35、40、45、50、55、60、65℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質(zhì)量濃度。由圖3可知，當酶解溫度達到50℃時，番茄皂苷A的質(zhì)量濃度達到最高。

圖3 酶解溫度對番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.3 酶解反應pH值對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，pH值分別調(diào)到2.5、3.0、3.75(番茄汁自身pH值)、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0(調(diào)到7.0時顏色突然變深)。加入0.4‰果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質(zhì)量濃度。由圖4可知，當酶解pH值為3.75～5.0時，酶解液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度最大。

圖4 酶解pH值對番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.4 酶解反應時間對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在50℃，pH4.0下，分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，每份酶解液取出后，立即離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質(zhì)量濃度。由圖5可知，當酶解時間達到2 h時，酶解液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度達到最大。

圖5 酶解時間對番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.3 番茄酶解正交實驗考慮到以上酶解單因素對番茄皂苷A提取效果均有不同程度的影響，并且4個單因素之間存在著交互的作用。因此，選取這4個單因素，在3個不同水平上，按照L9(34)正交表設計正交實驗。

2.3.1 正交因素與水平的設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2.3.2 正交實驗結果及方差分析見表2，表3。

表2 正交試驗結果與分析

表3 方差分析

由極差分析及方差分析可知，酶解法制得番茄清液中，番茄皂苷A質(zhì)量濃度或得率的影響因素主次順序為:C＞D＞A＞B，即影響酶解法中番茄皂苷A質(zhì)量濃度的因素依次是:酶用量＞酶解pH＞酶解溫度＞酶解時間。其中在所選定的3個水平下，酶添加量對番茄皂苷A的質(zhì)量濃度影響比較顯著。

因此確定酶解法最佳提取條件為:A3B2C2D2，即最佳提取工藝為:酶解溫度55℃，酶解時間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。

2.4 酶解工藝的驗證實驗精密稱取同一批次西紅柿6份，每份45 kg，分為加酶組和不加酶組，每組3份，加酶組機器打漿后按優(yōu)選出的最佳工藝條件進行酶解，并經(jīng)過大孔樹脂吸附制取總皂苷。另一組不加酶，機器打漿后直接離心過大孔柱吸附制取總皂苷。結果見表4，加酶組所得總皂苷平均得率為0.25%，明顯高于不加酶組的0.14%。并且在實驗中發(fā)現(xiàn)，不加酶組所得番茄汁含有大量絮狀細胞團，給離心及過柱帶來了極大困難。此外，由于番茄水分經(jīng)冷凍干燥法測定高達90%以上，在大生產(chǎn)中若采用溶劑提取法則很難實現(xiàn)，綜合考慮成本及可操作性，果膠酶法明顯優(yōu)于其他提取法。

表4 不同提取法總皂苷得率比較

3 分析與討論

3.1 番茄果實含水量高，經(jīng)測定在90%以上，若采用溶劑提取法則操作困難，成本必將很高。為使工藝過程更為高效而低成本，首先采用機械破碎的方式使大量細胞破壁促進內(nèi)含物充分釋放。機械破碎后得到的番茄漿黏度大，且存在大量未被充分破碎的細胞。為了使番茄細胞充分破碎及分離以提高番茄皂苷的得率及后續(xù)的過柱性能，本實驗設計采用果膠酶法并優(yōu)化其條件，實驗證明酶解工藝是高效可行的。

3.2 通過對影響酶解效率的4個因素進行單因素實驗，在單因素的基礎上對這4個單因素在3個水平上，按照L9(34)進行正交設計，實驗平行2份，對結果進行直觀分析及方差分析，得出最佳酶解工藝條件為:酶解溫度55℃，酶解時間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。其中在所選定的3個水平下，酶添加量對番茄皂苷A的質(zhì)量濃度影響比較顯著，因此在實際生產(chǎn)中，對果膠酶的用量要嚴格控制。

［1］Fujiwara Y，Kiyota N，Hori M，et al.Esculeogenin A，a New tomato sapogenol，ameliorates hyperlipidemia and atherosclerosis in ApoE-deficient mice by inhibiting ACAT［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(11):2400-2406.

［2］Tran QL，Tezuka Y，Banskota AH，New spirostanol steroids and steroidal saponins from roots and rhizomes of Dracaera angustifolia and their antiproliferactive activity［J］.J Nat Prod，2001，64(9):1127-1132.

［3］余洪波，張曉昱.酶法在中藥提取中的研究進展［J］.中成藥，2005，27(5):591-593.

［4］藍峻峰，劉琨.葉下珠有效成分的果膠酶法提取工藝［J］.中藥材，2010，33(1):135-137.

［5］李和生，孫玉喜，王鴻飛.果膠酶降解殼聚糖工藝優(yōu)化及特性動態(tài)變化分析［J］.農(nóng)業(yè)機械學報，2006，37(1):83-86.

［6］盧鳳來，劉金磊，陳月圓，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定番茄中的番茄皂苷A［J］.色譜，2010，28(9):908-911.

［7］趙江瓊，易以木，徐壹.香草醛比色法測定蔥白提取物中總皂苷含量［J］.醫(yī)學導報，2007，26(9):1075-1076.

［8］師文添，趙大云.HPLC-ELSD測定大豆皂苷含量［J］.食品工業(yè)科技，2010(12):346-348.

［9］蘇東林，單楊.酶法輔助提取柑桔皮總黃酮的工藝優(yōu)化研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2008，24(4):240-245.

［10］林碩，岳琳娜，高學玲，等.果膠酶提取絞股藍皂苷的工藝研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2009(4):21-24.

［11］孟碩，張鵬，劉建勛，等.果膠酶水解法對梔子提取液中環(huán)烯醚萜類成分的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(6):10-12.

［12］鄭瑞婷，劉長海，馬菽浩，等.果膠酶制取蘋果汁的優(yōu)化工藝研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2010(5):110-111.