藜?xì)g解郁顆粒的提取工藝研究

張文婷，劉梅，胡凱莉，奉建芳

(上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203)

抑郁癥是一種以悲傷、絕望和沮喪等情緒為特征的感性精神病，患者常有自卑、自責(zé)和自罪的感覺，并可有自殺傾向。抑郁癥作為精神科常見疾病，目前已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題，是危害人類健康的常見病。臨床多采用三環(huán)類藥物抗抑郁癥，但該類藥物存在易產(chǎn)生藥物依賴性及其它副作用，應(yīng)用受到一定限制［1］。我國的中醫(yī)藥對(duì)于防治抑郁癥方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，但是目前并沒有得到廣泛的應(yīng)用。一些藥物在開發(fā)的深度、廣度方面還有待進(jìn)一步提高［2］。

藜?xì)g解郁顆粒是由蒺藜、合歡花、石菖蒲、甘草等四味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，源自經(jīng)多年臨床驗(yàn)證的驗(yàn)方，具有抗抑郁的功效。藥材蒺藜為蒺藜科蒺藜屬植物蒺藜的干燥成熟果實(shí)，又名白蒺藜，蒺藜子，刺蒺藜;性味辛、苦，微溫，有小毒，入肝、肺經(jīng)，具有散風(fēng)、明目、下氣、行血等功效。主要藥效成分為黃酮類、甾體皂苷元，其中薯蕷皂苷元為主要成分。合歡花藥理作用有舒郁、理氣、安神、活絡(luò)?？芍委熡艚Y(jié)胸悶、健忘、失眠、視物不清、風(fēng)火眼疾、咽痛、癰腫、跌打損傷疼痛。合歡花的藥理實(shí)驗(yàn)表明合歡花水提物和醇提物均有抗抑郁療效。文獻(xiàn)報(bào)道中藥提取物的抗抑郁作用與單胺氧化酶(MAO)抑制作用有關(guān)，從銀杏葉中得到的山柰酚是潛在的MAO抑制劑，從貫葉金絲桃中得到的槲皮苷體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芤种芃AO—A的活性［3］，因此將槲皮苷作為合歡花的指標(biāo)成分。從臨床應(yīng)用來看，有人采用復(fù)方“蒺藜合歡飲”用于治療抑郁癥獲得較好的療效。石菖蒲為天南星科植物的干燥根莖，功效為開竅醒神，化濕和胃，寧神益志?，F(xiàn)代研究表明石菖蒲水煎劑、揮發(fā)油、或細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚均有鎮(zhèn)靜作用和抗驚厥作用。擬采用傳統(tǒng)的水煎煮法提取。本實(shí)驗(yàn)主要采用了水提工藝，并以甘草苷、槲皮苷、薯蕷皂苷元的含有量作為考察指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行了考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC-20高效液相色譜儀及紫外檢測器(日本島津);C-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特有限公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SG5200HE超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);DZF-6050真空干燥器(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);UV759紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);FW-100小型手提式藥材粉碎機(jī)(上海豐行篩網(wǎng)制造有限公司)。

1.2 試藥甘草苷、槲皮苷、薯蕷皂苷元對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)依次為111581-200708、111538-200403、111539-200001);所有藥材均購自上?？禈蛩幉挠邢薰荆?jīng)鑒定均符合《中國藥典》2010年版(一部)標(biāo)準(zhǔn);乙腈，甲醇為色譜純。其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草苷定量測定方法［4-5］

2.1.1 色譜條件檢測波長:250 nm;體積流量:1 mL/min;流動(dòng)相:乙腈-0.5%磷酸溶液(13∶87);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備精密吸取提取液10 mL(相當(dāng)于甘草生藥0.3 g)至燒杯中，加入28 mL 95%的乙醇，攪拌均勻，靜置醇沉約15 min，雙層濾紙抽濾，使用70%乙醇洗滌沉淀，每次10 mL，共2次，合并濾液后減壓蒸干。蒸干的殘?jiān)尤?0 mL水飽和正丁醇溶解，雙層濾紙過濾，濾液減壓蒸干后殘?jiān)尤?0 mL甲醇溶解，使用移液管精密移取1 mL甲醇溶液至10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品2.38 mg，置于10 mL量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻至完全溶解，即得質(zhì)量濃度為0.238 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別逐級(jí)稀釋得質(zhì)量濃度為1.19、2.38、4.76、11.9、23.8 μg/mL的對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，分別吸取對(duì)照液10 μL注入液相色譜儀中，測得甘草苷峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=7 973.12X－400.59，r=0.999 7。結(jié)果甘草苷質(zhì)量濃度在1.19～23.8 μg/mL與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 定量測定精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測定甘草苷色譜峰面積，計(jì)算甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 槲皮苷定量測定方法［6］

2.2.1 色譜條件檢測波長:250 nm;體積流量:0.8 mL/min;流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備精密吸取提取液10 mL(相當(dāng)于合歡花生藥0.6 g)至燒杯中，照2.1.2項(xiàng)方法制備得供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品4.66 mg，置于10 mL量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻至完全溶解，即得質(zhì)量濃度為0.466 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別逐級(jí)稀釋得質(zhì)量濃度為2.33、4.66、9.32、23.3、46.6、69.9 μg/mL的對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，分別吸取對(duì)照液10 μL注入液相色譜儀中，測得槲皮苷峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=32 723.87X－19 787.50，r=0.999 7。結(jié)果槲皮苷質(zhì)量濃度在2.33～69.9 μg/mL與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 定量測定精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測定槲皮苷色譜峰面積，計(jì)算槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 薯蕷皂苷元定量測定方法［7］

2.3.1 色譜條件檢測波長:206 nm;體積流量:1 mL/min;流動(dòng)相:乙腈-水(81∶19);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備精密吸取提取液26 mL(相當(dāng)于蒺藜生藥1.95 g)至500 mL圓底燒瓶中，加入34 mL 2%稀硫酸溶液和140 mL甲醇，搖勻，置于80℃水浴中，加熱回流2 h。取出圓底燒瓶冷卻至室溫，雙層濾紙抽濾，將濾液倒入分液漏斗中，使用30 mL 60～90℃石油醚萃取兩次，再用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL。合并石油醚和三氯甲烷的萃取液，減壓蒸干，精密加入10 mL甲醇溶解殘?jiān)?.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品4.38 mg，置于10 mL量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻至完全溶解，即得質(zhì)量濃度為0.438 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別逐級(jí)稀釋得質(zhì)量濃度為4.38、8.76、21.9、43.8、65.7 μg/mL的對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，分別吸取對(duì)照液10 μL注入液相色譜儀中，測得薯蕷皂苷元峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=4 983.49X－1 380.07，r=0.999 4。結(jié)果薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度在4.38～65.7 μg/mL與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3.4 定量測定精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測定薯蕷皂苷元色譜峰面積，計(jì)算薯蕷皂苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4 單因素考察

2.4.1 粉碎度的考察將每種藥材單獨(dú)經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過篩，分別過1號(hào)篩、2號(hào)篩、3號(hào)篩。分別稱取未經(jīng)粉碎藥材、1號(hào)篩粉、2號(hào)篩粉、3號(hào)篩粉藥材的復(fù)方，藥材用12倍量的水浸泡20 min，加熱煎煮提取兩次，每次1 h，第2次加入8倍量水煎煮。提取液趁熱過濾，合并兩次濾液，濾液適當(dāng)濃縮，樣品處理后即進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果見表1。

表1 不同粉碎程度的指標(biāo)成分含有量(n=3)

以甘草苷、槲皮苷和薯蕷皂苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，3號(hào)篩粉的3種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，但是由于3號(hào)篩粉過細(xì)，煎煮液黏稠不利于提取，因此選擇2號(hào)篩粉為復(fù)方提取的粉碎度。

2.4.2 提取次數(shù)的考察稱取處方量各藥材(2號(hào)篩粉)，藥材用8倍量水浸泡20 min，加熱煎煮提取，分別提取1次、2次、3次，每次提取1 h。提取液趁熱過濾合并，濾液濃縮至200 mL，即得樣品提取液，提取液檢測甘草苷、槲皮苷和薯蕷皂苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取上述制備的樣品供試品進(jìn)高效液相色譜儀檢測，結(jié)果見表2。

表2 不同提取次數(shù)的指標(biāo)成分含有量(n=3)

以甘草苷、槲皮苷和薯蕷皂苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，提取1次的3種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少，提取2次、3次的3種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故選擇提取2次為實(shí)驗(yàn)提取次數(shù)。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 方法稱取處方量各藥材(2號(hào)篩粉)，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。藥材用相應(yīng)倍量的水浸泡相應(yīng)時(shí)間，加熱煎煮提取。提取液趁熱過濾，濾液濃縮至200 mL，即得樣品提取液。

2.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，影響因素有加水量、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，見表3。

表3 因素水平

2.5.3 最佳工藝確定按甘草苷、槲皮苷、薯蕷皂苷元的權(quán)重都為0.33進(jìn)行綜合評(píng)分，綜合質(zhì)量評(píng)分Y=各樣品中甘草苷含有量÷9個(gè)樣品中甘草苷最高含有量×0.33+各樣品中槲皮苷含有量÷9個(gè)樣品中槲皮苷最高含有量×0.33+各樣品中薯蕷皂苷元含量÷9個(gè)樣品中薯蕷皂苷元最高含有量×0.33［8-9］。以綜合評(píng)價(jià)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表4，5。

表4 藜?xì)g解郁顆粒提取工藝正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表中指標(biāo)成分的數(shù)據(jù)均為單位生藥材中的含有量按權(quán)重計(jì)算后的綜合評(píng)分。

表5 藜?xì)g解郁顆粒正交試驗(yàn)綜合評(píng)分方差分析

由方差分析表極差分析，A因素應(yīng)取A3，即加入12倍量水，B因素應(yīng)取B2，即提取時(shí)間1.5 h，C因素應(yīng)取C3，即浸泡45 min。綜上所述，復(fù)方的最佳提取工藝為加12倍水，提取兩次，每次1.5 h，浸泡45 min。

2.5.4 最佳工藝驗(yàn)證為進(jìn)一步確定最佳提取工藝，對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)［10-11］，稱取藥材，按上述優(yōu)選工藝進(jìn)行操作，結(jié)果見表6。

3批驗(yàn)證試驗(yàn)表明，各項(xiàng)指標(biāo)高于正交試驗(yàn)的結(jié)果，且差別較小，表明優(yōu)化的工藝穩(wěn)定可行。

表6 復(fù)方提取工藝驗(yàn)證(n=3)

3 討論

3.1 藜?xì)g解郁顆粒源自經(jīng)多年臨床驗(yàn)證的驗(yàn)方，具有抗抑郁的功效。目前抗抑郁的中藥的研究較少，因此開發(fā)藜?xì)g解郁顆粒具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。有效成分含有量的高低是藥物療效的重要評(píng)價(jià)因素，本方由多味中藥組成，如果以單一指標(biāo)成分進(jìn)行工藝篩選，不能保證本方的整體質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)考察了君藥蒺藜、以及合歡花、甘草的主要指標(biāo)成分薯蕷皂苷元、槲皮苷、和甘草苷的含有量，以加權(quán)綜合評(píng)分作為篩選最佳工藝的依據(jù)，兼顧方中多味藥的有效成分含有量，使結(jié)果更具有代表性、合理性、全面性和科學(xué)性。

3.2 中藥復(fù)方提取工藝是保證制劑質(zhì)量的關(guān)鍵，本次試驗(yàn)對(duì)于提取工藝的研究，應(yīng)用了多種提取手段和方法，采用先單因素考察確定了最佳的粉碎度和提取次數(shù)，后通過多因素正交試驗(yàn)優(yōu)選加水量、提取時(shí)間和浸泡時(shí)間的方法確定較好的提取工藝，并經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)證明工藝穩(wěn)定可行。有力的保證了藜?xì)g解郁顆粒的研制。

3.3 在工藝研究過程中考慮到工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際，本工藝簡單合理，易于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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