大孔樹脂分離純化羥基酪醇工藝研究

黨建章，金元寶，毛友枚，代建國，金剛

(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)系，廣東深圳518055)

歐橄欖(Olea europaea L.)也稱油橄欖是地中海國家著名的亞熱帶果樹和重要經(jīng)濟林木，含豐富優(yōu)質(zhì)食用植物油—橄欖油，同時含有豐富多樣的酚類化合物［1-3］。大量研究表明:該酚類化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抑制DNA氧化損傷、保護皮膚光損傷以及抗炎等活性［4-6］。研究還表明:橄欖葉中含有的抗氧化活性的酚類化合物的量明顯高于橄欖果、樹皮和橄欖油。近年來全國歐橄欖種植面積逐年增加，預(yù)計今后10年我國歐橄欖產(chǎn)業(yè)將進入蓬勃發(fā)展期［7］，屆時將有大量廉價的橄欖葉供應(yīng)，為橄欖葉提取物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了廣闊的空間，具有良好的發(fā)展前景。

羥基酪醇(Hydroxytyrosol)化學(xué)名為3，4-二羥基苯乙醇，屬兩性分子，既脂溶也水溶。羥基酪醇有很強的抗氧化作用，能阻止多不飽和脂肪酸的自氧化，羥基酪醇對自由基的清除能力比其他抗氧化物質(zhì)都高，可有效地清除內(nèi)源性和外源性的自由基和氧化物，包括過氧化氫、超氧化物陰離子以及次氯酸等，是一種值得研究和大力開發(fā)的天然食品抗氧化劑。自然界中天然的羥基酪醇很少以游離的形式存在，由于橄欖葉中含有0.5%～2.0%的橄欖苦苷(oleuropein)，因此國外實驗室多用硫酸或鹽酸來酸解橄欖苦苷生產(chǎn)羥基酪醇［8］，酸解過程見圖1。

圖1 橄欖苦苷酸解生成羥基酪醇

目前從橄欖葉中分離純化羥基酪醇，國內(nèi)還剛起步，本實驗在現(xiàn)有的工作基礎(chǔ)上［9-10］，篩選適用的大孔吸附樹脂進一步分離純化羥基酪醇，為羥基酪醇的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、材料和試劑

LC-20A島津高效液相色譜儀:包括二元泵、DAD檢測器、柱溫箱、真空脫氣機、自動進樣器;LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵;美國PALL cascada IX型超純水制備儀;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器;日本TOMY KOGYO CO，LD自動高壓滅菌鍋。

羥基酪醇對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號為080928，純度≥98%;橄欖葉由深圳市力可生物技術(shù)有限公司提供(西班牙進口)，橄欖苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%，羥基酪醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%;Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑購自天津正天成澄清技術(shù)有限公司;大孔吸附樹脂AMBERLITE-XAD4(簡稱XAD4)由深圳市力可生物技術(shù)有限公司提供，HP20、LX-18C、HPD400A購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;色譜純?nèi)宜?、甲醇、乙腈購自天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司;水為重蒸蒸餾水;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 羥基酪醇定量測定［9］

2.1 色譜條件流動相:A為三氟乙酸水溶液(pH 2.5)，B為乙腈，體積流量:1 mL/min，檢測波長:280 nm，柱溫:30℃，檢測時間:30 min，進樣量:5 μL，羥基酪醇保留時間約為10.5 min左右，梯度洗脫程序為:流動相B:0 min 5%;30 min 25%。

2.2 對照品貯備液的制備精密稱取羥基酪醇對照品10.0 mg，置100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成0.1 mg/mL的貯備液備用。

2.3 對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定用LC-20A島津高效液相色譜儀檢測，對照品的進樣量為1、5、10、20、40 μL，以對照品進樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)計算回歸方程，結(jié)果表明羥基酪醇在0.1 μg～4μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為:Y=748 755X-7 166.6(r=0.999 2)。

2.4 樣品羥基酪醇純度的測定精密稱取經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥至恒質(zhì)量的樣品，用60%甲醇定容，HPLC檢測，根據(jù)回歸方程計算得到橄欖苦苷含有量，按下式計算橄欖苦苷純度。橄欖苦苷純度=固形物中橄欖苦苷質(zhì)量/固形物質(zhì)量×100%。

3 方法與結(jié)果

3.1 羥基酪醇的粗提取稱取干燥并粉碎的橄欖葉，按照料液比1∶30加入0.5 mol/L HCl，在溫度105℃、壓力20.79 kPa(高壓滅菌鍋表壓)條件下水解15 min，趁熱過濾，濾液冷卻至室溫后，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 5，加入經(jīng)預(yù)處理的ZTC1+1天然澄清劑，ZTC1+1添加量為:B組分的最終質(zhì)量濃度為0.2 g/L;A組分的最終質(zhì)量濃度為0.1 g/L，添加順序為先加B組分后再加A組分，加完每一種組分后都放置在100℃的水浴鍋中水浴2 h，水浴完成后，冷卻至室溫，真空抽濾，除去濾渣，按上述條件澄清3次后備用，稱為粗提液，粗提液羥基酪醇質(zhì)量濃度為0.62 mg/mL。

3.2 大孔樹脂預(yù)處理大孔樹脂用95%乙醇浸泡過夜，清洗后，再換用95%乙醇浸泡120min，然后用蒸餾水洗至無醇味后備用。

3.3 大孔樹脂篩選分別稱取預(yù)處理的HP20、LX-18C、AMBERLITE-XAD4(簡稱XAD4)、HPD400A樹脂各10 g，裝具塞瓶中，每種樹脂稱取兩份，每份樹脂中加粗提液50 mL(經(jīng)前期試驗確定的加量)，30℃，120 r/min振蕩吸附過夜，真空抽濾，抽濾后每份樹脂中加蒸餾水50 mL，30℃振蕩洗滌5 min，然后抽濾，分別檢測吸附液和水洗液。在吸附后的樹脂中各加入40%乙醇50 mL，30℃振蕩120 min解析，然后真空抽濾，解析液取樣檢測，重復(fù)上述解析過程，共解析3次，平均結(jié)果見表1。

表1 4種樹脂吸附和解析率的實驗結(jié)果

從上述結(jié)果可知:XAD4樹脂和LX-18C樹脂的吸附率、水洗率、解析率都較理想，從樹脂來源和成本綜合考慮我們選擇XAD4樹脂繼續(xù)以下實驗。

3.4 XAD4樹脂的吸附時間稱取預(yù)處理的XAD4樹脂100 g，加粗提液500 mL，每隔30 min，取樣檢測羥基酪醇的峰面積，計算吸附率。結(jié)果見表2(表中的實驗數(shù)據(jù)為平行實驗2次的平均結(jié)果)。

表2 XAD4樹脂吸附時間的選擇

從上述結(jié)果可知:XAD4樹脂吸附120 min后，吸附率可達90.2%，因此吸附時間以120 min為宜。

3.5 乙醇解析濃度的確定取上述吸附羥基酪醇的樹脂100 g，加蒸餾水500 mL洗滌，真空抽濾，洗水取樣檢測，峰面積為55 985，羥基酪醇損失率為2.4%;稱取上述抽濾后的樹脂10 g，共3份，每份中分別加入20%、40%、60%的乙醇50 mL，37℃振蕩解析，解析120 min后取樣檢測，按上述條件再重復(fù)解析一次，結(jié)果見表3(表中的實驗數(shù)據(jù)為平行實驗2次的平均結(jié)果)。

從上述結(jié)果可知:選用60%乙醇解析，兩次解析率之和為89.3%。

3.6 XAD4樹脂的放大實驗稱100 g經(jīng)處理的XAD4樹脂，加入500 mL上述澄清液，吸附飽和、洗滌后加入60%乙醇500 mL，37℃振蕩解析120 min，抽濾收集解析液，按以上條件再解析一次，將兩次解析液合并，取樣待檢，然后將合并的解析液濃縮至45 mL，取樣待檢。用乙酸乙酯進行萃取，經(jīng)3次萃取后合并萃取液，總體積為300 mL，將萃取液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，干燥器干燥24 h稱質(zhì)量(蒸發(fā)干燥后的瓶質(zhì)量減去蒸發(fā)前的瓶質(zhì)量)，得到羥基酪醇的干質(zhì)量為438.7 mg，蒸餾瓶用60%甲醇溶解并洗滌，溶解樣定容到30 mL，取樣待檢，結(jié)果見表4。

表3 不同含乙醇量解析的解析結(jié)果

表4 XAD4樹脂的放大實驗結(jié)果

從上述結(jié)果可知:采用XAD4樹脂分離純化羥基酪醇其吸附率為91.1%，解析率為91.6%，純度可達44.1%。

4 討論

4.1 本實驗采用樹脂靜態(tài)吸附和靜態(tài)解析，簡化了工藝，工業(yè)上只需帶攪拌的搪瓷罐進行吸附和解析，省去了樹脂柱，降低了成本，具有實用價值。

4.2 羥基酪醇為油狀物，濃縮后不能用常規(guī)的噴霧干燥器干燥，在濃縮物中加入適當(dāng)?shù)奶畛鋭?，使產(chǎn)品成粉末狀，還有待進一步研究。

［1］柏方敏.油橄欖產(chǎn)業(yè)考察報告［J］.湖南林業(yè)科技，2008，35(1):36-38.

［2］Keys A.Mediterranean diet and public health:personal reflections［J］.Am J Clin Nutr，1995，61(6):1321–1323.

［3］Fernández-Bola?os JG，López ó，F(xiàn)ernández-Bola?os J，et al.Hydroxytyrosol and derivatives:isolation，synthesis，and biological properties［J］.Current Organic Chemistry，2008，12(6):442-463.

［4］Vissers MN，Zock PL，Katan MB.Bioavailability and antioxidant effects of olive oil phenols in humans:a review［J］.Eur J Clin Nutr，2004，58:955-965.

［5］張小梅.羥基酪醇生物學(xué)作用的細(xì)胞與分子機制研究［D］.大連:大連醫(yī)科大學(xué)，2008.

［6］Schaffer S，Podstawa M，Visioli F，et al.Hydroxytyrosol-rich olive mill wastewater extract protects brain cells in vitro and ex vivo［J］.J Agric Food Chem，2007，55(13):5043-5049.

［7］張東升，黃易，夏自謙.論我國油橄欖產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃［J］.林產(chǎn)工業(yè)，2010，37(2):50-55.

［8］De Leonardis A，Aretini A，Alfano G，et al.Isolation of a hydroxytyrosol-rich extract from olive leaves(Olea Europaea L.)and evaluation of its antioxidant properties and bioactivity［J］.Eur Food Res Technol，2008，226(14):653-659.

［9］黨建章，侯金星，黃志斌，等.鹽酸水解橄欖苦苷粗提物制備羥基酪醇［J］.中藥材，2011，34(6):983-985.

［10］金元寶，黨建章，代建國，等.羥基酪醇分離純化方法研究進展［J］.食品科技，2011，36(7):174-177.