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    量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用①

    2012-01-25 14:13:31李文君侯玉澤胡驍飛裴亞峰張改平鄧瑞廣
    中國免疫學(xué)雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:生物素偶聯(lián)層析

    李文君 侯玉澤 胡驍飛 王 坤 裴亞峰 張改平 鄧瑞廣

    (河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽471003)

    1959年,Yalow等[1]將放射性同位素示蹤與免疫反應(yīng)相結(jié)合建立了放射免疫測(cè)定法,實(shí)現(xiàn)了痕量分析化學(xué)方面的重大突破,從而開創(chuàng)了標(biāo)記免疫分析這一嶄新領(lǐng)域。此后,一系列標(biāo)記免疫分析方法紛紛涌現(xiàn)并不斷發(fā)展,如酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫測(cè)定法、免疫層析測(cè)定法、免疫傳感器測(cè)定法等等。免疫分析已經(jīng)發(fā)展成為一門跨學(xué)科新型分析技術(shù)。隨著人們對(duì)免疫學(xué)理論認(rèn)識(shí)的深入,各種免疫分析檢測(cè)技術(shù)也不斷地被完善。目前,免疫分析檢測(cè)技術(shù)正朝著定量、多組份分析;高靈敏度、高特異性、方便快捷、經(jīng)濟(jì)適用的方向發(fā)展。量子點(diǎn)標(biāo)記免疫技術(shù)由于具有上述特征,而受到廣泛關(guān)注。

    1 量子點(diǎn)

    1.1 量子點(diǎn)的特性 量子點(diǎn)主要是由主族元素Ⅱ~Ⅵ,Ⅲ~Ⅴ如CdSe、CdTe、InP組成的納米顆粒,粒徑一般介于1~100 nm之間。由于電子和空穴被量子限域,連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu),受激后可以發(fā)射熒光。量子點(diǎn)由于存在顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng),從而使它具有常規(guī)材料所不具備的光吸收特性,使其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣,特別是其在臨床檢驗(yàn)學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)研究中的應(yīng)用價(jià)值,引起了科學(xué)工作者的極大關(guān)注,發(fā)光量子點(diǎn)作為熒光探針標(biāo)記生物大分子,是近年來納米材料在生物分析領(lǐng)域的重要應(yīng)用之一[2-4]。作為一種新型的熒光探針,與傳統(tǒng)的試劑相比具有以下特性:量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度強(qiáng),穩(wěn)定性好,抗漂白能力強(qiáng)。Chan等[2]通過實(shí)驗(yàn)證明ZnS包覆的CdSe比羅丹明6G分子要亮20倍和穩(wěn)定100~200倍,可以受多次激發(fā),并且標(biāo)記后對(duì)生物大分子的生理活性影響很小,因此為研究生物大分子之間的長期作用提供了可能。量子點(diǎn)的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了它具有表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、介電限域效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)[5]。

    量子點(diǎn)具有“調(diào)色”功能,不同粒徑的量子點(diǎn)具有不同的顏色,激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)波長范圍很寬,且連續(xù)分布,所以可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)而獲得多種顏色標(biāo)記,是一類理想的熒光探針[3,6]。

    激發(fā)波長比較寬,而發(fā)射波長比較窄。量子點(diǎn)的激發(fā)光波長范圍很寬,只要能量大于其最小激發(fā)波長的光都可以對(duì)其進(jìn)行激發(fā)[7]。同時(shí)量子點(diǎn)還具有較大的斯托克位移和狹窄對(duì)稱的熒光譜峰,其半高峰寬常常只有40 nm或更小,這樣就允許同時(shí)使用不同光譜特征的量子點(diǎn),發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊,或只有很少交疊,使標(biāo)記生物分子熒光譜的區(qū)分、識(shí)別變得很容易。

    良好的生物兼容性。用量子點(diǎn)做標(biāo)記物對(duì)生物大分子標(biāo)本的活性無傷害,而且量子點(diǎn)與生物大分子的偶聯(lián)方法和方式相對(duì)比較單一,不像傳統(tǒng)的標(biāo)記試劑,每種試劑都需要特定的偶聯(lián)方法。

    量子點(diǎn)熒光壽命長。典型的有機(jī)熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns),這與很多樣本的自發(fā)熒光衰減的時(shí)間相當(dāng)。而量子點(diǎn)的熒光壽命可持續(xù)長達(dá)數(shù)十納秒(20 ns~50 ns),這使得當(dāng)光激發(fā)數(shù)納秒以后,大多數(shù)的自發(fā)熒光背景已經(jīng)衰減,而量子點(diǎn)熒光仍然存在,此時(shí)即可獲得無背景干擾的熒光信號(hào)[2,8]。

    2 量子點(diǎn)與靶標(biāo)分子偶聯(lián)

    2.1 量子點(diǎn)與生物大分子偶聯(lián) 近四十年來,量子點(diǎn)的制備從有機(jī)相到水相,從低熒光量子產(chǎn)率到高熒光量子產(chǎn)率,從短熒光壽命到長熒光壽命,量子點(diǎn)的制備技術(shù)在不斷發(fā)展。目前,量子點(diǎn)的制備主要有兩種途徑,即有機(jī)相制備和水相制備。有機(jī)相中制備的量子點(diǎn)具有較高的熒光量子產(chǎn)率、較窄的熒光半峰寬、較好的單分散性和穩(wěn)定性,但存在試劑毒性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)成本高、操作安全性低等諸多缺點(diǎn)。水相制備量子點(diǎn)具有試劑無毒、廉價(jià)、操作簡單、環(huán)境友好及高度的重現(xiàn)性[9,10]。同時(shí),水相合成的量子點(diǎn)由于本身帶有-COOH,不必經(jīng)過繁瑣的轉(zhuǎn)相程序就可以直接溶于水溶液中,與生物分子進(jìn)行連接[11]。目前已報(bào)道的連接方法都是基于下列原理:雙功能連接試劑法、靜電吸引法和生物素-親和素法。

    2.1.1 雙功能連接試劑法 交聯(lián)劑是一類小分子化合物,分子量一般在200~600之間,具有2個(gè)或者更多的針對(duì)特殊基團(tuán)(氨基、巰基等)的反應(yīng)性末端,可以和2個(gè)或者更多的分子分別偶聯(lián)從而使這些分子結(jié)合在一起[12]。

    2.1.2 靜電吸引法 正電荷氫核遇到另一個(gè)電負(fù)性強(qiáng)的原子時(shí),就產(chǎn)生靜電吸引。表面帶負(fù)電的量子點(diǎn)與帶正電的雙功能重組蛋白區(qū)域可通過靜電吸引連接起來,而不需要其他試劑,且已成功的用于細(xì)胞成像[13]。Wu 等[14]利用直徑在 7.4 ~ 10 nm 的CdSe-ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記了細(xì)胞,同時(shí)識(shí)別細(xì)胞表面的Her2及胞漿微管蛋白,用來檢測(cè)核抗原。

    2.1.3 生物素-親和素法 生物素-親和素系統(tǒng)(Biotin-avidin system,BAS)是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué),并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng),在生命科學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。由于它具有生物素與親和素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng),并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合,使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高[15]。

    2.2 量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白質(zhì) 量子點(diǎn)最初用于生物領(lǐng)域是應(yīng)用于簡單的生物大分子,鏈接方法是將量子點(diǎn)用帶有氨基或羧基的試劑修飾,改變?nèi)芤涵h(huán)境,通過共價(jià)偶聯(lián)或靜電作用等完成量子點(diǎn)與生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸和生物酶等)的鏈接。

    曾慶輝等[16]應(yīng)用連續(xù)離子層吸附反應(yīng)(SILAR)技術(shù),在水溶液中合成了高效穩(wěn)定的CdTe/CdS核殼量子點(diǎn),通過靜電吸附與共價(jià)連接兩種方式對(duì)人免疫球蛋白IgG進(jìn)行標(biāo)記。電泳技術(shù)已證明,應(yīng)用這種量子點(diǎn)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)分子的生物標(biāo)記。

    Hua等[17]通過巰基乙酸對(duì)有機(jī)溶劑里的量子點(diǎn)進(jìn)行改性,然后用EDC和NHS使量子點(diǎn)與羊抗人抗體偶聯(lián)。柱子純化以后進(jìn)行表征分析發(fā)現(xiàn),羊抗人抗體的圓二色性光譜圖和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體以后的色譜圖相近,表明了抗體在與量子點(diǎn)偶聯(lián)以后的二級(jí)結(jié)構(gòu)仍然很完整。最后又進(jìn)行了抗原抗體的識(shí)別反應(yīng),印證了耦合物保留了抗體的活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了用量子點(diǎn)標(biāo)記生物蛋白是可行的,同時(shí)也為量子點(diǎn)在生命科學(xué)的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

    3 量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在熒光免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

    3.1 量子點(diǎn)標(biāo)記抗原抗體的熒光免疫分析 目前量子點(diǎn)標(biāo)記最為活躍的領(lǐng)域是在熒光免疫方面。借助于抗原-抗體之間的特異性識(shí)別作用完成各種研究。1998年,Chan等[2]發(fā)現(xiàn)在牛血清蛋白(BSA)中,多克隆抗體能識(shí)別量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫球蛋白(IgG),使量子點(diǎn)聚集在一起;而沒有這種抗體,QDIgG結(jié)合體均勻地分散于BSA中,證明用量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫球蛋白分子(IgG)能識(shí)別專一的抗原和抗體。這一研究為以后的量子點(diǎn)在熒光免疫分析中的研究奠定了基礎(chǔ)。

    2002年,Goldman等[18]將量子點(diǎn)與抗體結(jié)合用于熒光免疫分析。他們利用工程重組蛋白通過靜電作用結(jié)合到量子點(diǎn)上,然后再與抗體結(jié)合,通過親和色譜將結(jié)合與來結(jié)合的分子分離,再將與抗體連接的量子點(diǎn)應(yīng)用直接與間接ELISA的方法成功的對(duì)葡萄球菌腸毒素和2,4,6-三硝基甲苯進(jìn)行了熒光免疫分析。后來,Goldman等[19]又將抗生物素蛋白作為一種受體蛋白與量子點(diǎn)連接,從而使量子點(diǎn)可以與生物素化的蛋白偶聯(lián)。這種受體蛋白為將抗體連接到量子點(diǎn)上提供了一種分子連接的橋梁。也使抗體與量子點(diǎn)的偶聯(lián)物能應(yīng)用于熒光免疫分析。應(yīng)用這種方法去檢測(cè)毒素,如SEB、choleratoxin等,可以達(dá)到用有機(jī)染料進(jìn)行標(biāo)記的同等的檢測(cè)限。Lingerfelt等[20]也用交聯(lián)生物素的量子點(diǎn)對(duì)葡萄球菌腸毒素B進(jìn)行了免疫色譜檢測(cè),這種方法的檢測(cè)限最低可達(dá)10 ng/ml。

    2011年,楊淑平等[21]分別采用巰基乙酸和谷胱甘肽作穩(wěn)定劑,水相合成CdTe量子點(diǎn),再包覆CdS制備核殼型CdTe/CdS量子點(diǎn)。以EDC和NHS作交聯(lián)劑將CdTe/CdS量子點(diǎn)標(biāo)記到嘔吐毒素抗體上,然后用牛血清蛋白封閉抗體。研究發(fā)現(xiàn),谷胱甘肽穩(wěn)定劑優(yōu)于巰基乙酸。與CdTe量子點(diǎn)相比,谷胱甘肽修飾的CdTe/CdS量子點(diǎn)其熒光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性分別提高6倍和2倍以上。監(jiān)測(cè)不同儲(chǔ)藏時(shí)間的CdTe/CdS量子點(diǎn)-抗體復(fù)合物與嘔吐毒素免疫反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度變化值,結(jié)果顯示抗體至少可以穩(wěn)定7天。由此建立了一種新的嘔吐毒素?zé)晒饷庖弑O(jiān)測(cè)方法。

    3.2 量子點(diǎn)標(biāo)記生物素親和素的熒光免疫分析2009年,錢建瑞等[22]利用量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為標(biāo)記試劑,將生物素-親和素系統(tǒng)應(yīng)用于熒光免疫分析中,建立了一種測(cè)定雌三醇含量的分析方法。在選定的實(shí)驗(yàn)條件下,雌三醇濃度在0.01~1000 ng/ml濃度范圍內(nèi)與相對(duì)熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系,方法的檢出限為 0.0029 ng/ml。對(duì) 0.1 ng/ml和100 ng/ml的雌三醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行十次平行測(cè)定,求得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

    2011年,劉曉紅等[23]建立了熒光量子點(diǎn)標(biāo)記-免疫分析技術(shù)聯(lián)用檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的方法。通過抗原抗體反應(yīng),結(jié)合生物素與親和素間的特異性相互作用,將QDs特異性標(biāo)記在炭疽芽孢桿菌上,并利用熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)進(jìn)行了驗(yàn)證。采用實(shí)驗(yàn)室自制的便攜式熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)標(biāo)記QDs的炭疽芽孢桿菌樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。表明炭疽芽孢桿菌濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R為0.9554,檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。

    3.3 量子點(diǎn)標(biāo)記與免疫層析快速檢測(cè)技術(shù) 將熒光分析與免疫層析結(jié)合起來,量子點(diǎn)在萊克多巴胺及鹽酸克倫特羅的快速檢測(cè)中相較于膠體金靈敏度有了較大的提高。

    2009年,張國華等[24]通過萊克多巴胺抗原抗體的制備、量子點(diǎn)的制備、試紙條的組裝和測(cè)試等步驟研究一種將量子點(diǎn)應(yīng)用于萊克多巴胺免疫層析試紙條的新方法。結(jié)果表明,萊克多巴胺快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限為3 ng/ml,檢測(cè)時(shí)間為10分鐘。以量子點(diǎn)為標(biāo)記物通過免疫層析的方法檢測(cè)RAC,是對(duì)以往膠體金層析技術(shù)的一種突破,實(shí)驗(yàn)證明利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光特性將量子點(diǎn)作為標(biāo)記物取代膠體金可以提高RAC試紙條的檢測(cè)限,同時(shí)能夠很好的保證以往RAC膠體金試紙條的檢測(cè)范圍和檢測(cè)的特異性。

    2010年,胡華軍等[25]采用巰基丁二酸作為表面修飾劑,水相法合成水溶性的CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn),然后在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的作用下,將CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)與抗克倫特羅多克隆抗體(Anti-CLE pAb)連接。通過凝膠電泳和斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)與Anti-CLE pAb連接成功,并且CdTe/ZnSe-Anti-CLEpAb偶聯(lián)物能識(shí)別克倫特羅-BSA抗原(CLE-BSA)。將合成的CdTe/ZnSe-Anti-CLE pAb偶聯(lián)物作為指示克倫特羅(CLE)分子的熒光標(biāo)記物,制備出一種用于檢測(cè)CLE的免疫層析試紙條,其最低檢測(cè)量可達(dá)1μg/L。此結(jié)果表明量子點(diǎn)能用作熒光標(biāo)記物制備快速檢測(cè)免疫層析試紙條,能滿足國家對(duì)食品安全檢測(cè)快速、靈敏的要求。

    4 展望

    綜合現(xiàn)在的免疫學(xué)檢測(cè)方法,量子點(diǎn)在標(biāo)記免疫分析方面展現(xiàn)了誘人的前景。相較于以往的有機(jī)熒光染料,其具有熒光強(qiáng)度強(qiáng)、穩(wěn)定性好、熒光壽命長的特點(diǎn)。因此可以完全取代過去的有機(jī)染料進(jìn)行熒光分析。另外將熒光分析與免疫層析相結(jié)合應(yīng)用于現(xiàn)在的免疫層析快速檢測(cè),其靈敏性相較于膠體金有較大的提高。相信,隨著量子點(diǎn)制備及標(biāo)記技術(shù)的成熟,其將在生物醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。另外利用不同粒徑量子點(diǎn)具有不同顏色的特點(diǎn)將不同的量子點(diǎn)標(biāo)記不同的抗體,并且制備成免疫層析試紙條,將有望實(shí)現(xiàn)利用一條試紙條同時(shí)檢測(cè)不同的物質(zhì),極大的提高了食品安全檢測(cè)的效率。但是,量子點(diǎn)在制備過程中的穩(wěn)定性及量子產(chǎn)率還仍然存在問題,仍是我們?cè)谘芯苛孔狱c(diǎn)標(biāo)記技術(shù)及應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)中不可忽視的難題。

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    25 胡華軍,付 濤,張明洲 et al.CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測(cè)克倫特羅的研究[J].分析化學(xué),2010;38(12):1727-1731.

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