自制NSE單抗的鑒定及其雙抗夾心ELISA方法的建立①

丁煥弟 林志妙 楊 赟 于占嬌 龔慧婷 李曉彤

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院雜交瘤抗體中心，廈門361005)

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)是烯醇化酶的一種同工酶，烯醇化酶是普遍存在于生物體內(nèi)的糖酵解代謝酶，它催化中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸的生成。目前已發(fā)現(xiàn)5種烯醇化酶的同工酶，由3種免疫性質(zhì)不同的亞基(α、β、γ)組成，分別是 αα、ββ、γγ、αβ、αγ，已經(jīng)證明這 3個(gè)亞基來(lái)自不同的基因位點(diǎn)［1］。α亞基主要存在于肝、腎等組織，故稱其為非神經(jīng)系統(tǒng)的烯醇化酶(NNE);β亞基主要存在于骨骼肌和心肌，故稱其為肌肉特異性的烯醇化酶(MSE);γ亞基主要存在于神經(jīng)組織，γγ型特異定位于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，故命名為神經(jīng)元特異性烯醇化酶［2］。

通過(guò)研究神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞起源的腫瘤，如小細(xì)胞肺癌患者血清及腦脊液中NSE水平明顯升高，提出通過(guò)對(duì)這些患者血清NSE活性水平變化的監(jiān)測(cè)，可以達(dá)到監(jiān)測(cè)病情發(fā)展，評(píng)價(jià)治療效果，及早提示復(fù)發(fā)情況的目的。

本文希望通過(guò)制備效價(jià)高、特異性好、能識(shí)別人體內(nèi)NSE蛋白的單克隆抗體，并用此抗體建立雙抗夾心ELISA試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料 PEG、HT、HAT、RPMI1640 培養(yǎng)基、抗體亞型鑒定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG以及熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購(gòu)自Sigma公司;小牛血清購(gòu)自Gibco。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自泰天和生物公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 NSE單克隆抗體的制備及亞型鑒定 取小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合［3］，通過(guò)間接 ELISA 法篩選［4］，采用有限稀釋法進(jìn)行數(shù)次亞克隆，獲得可穩(wěn)定分泌NSE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，按常規(guī)方法制備腹水并純化。采用間接ELISA法梯度稀釋制備的抗體，測(cè)定其效價(jià)，并采用免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞型鑒定試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定，用山羊抗鼠 IgA、IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，檢測(cè)抗體的亞型，亞型鑒定的具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 免疫印跡分析(Western blot，WB) 將收集的細(xì)胞裂解液，首先進(jìn)行SDS-PAGE電泳;然后用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫2小時(shí);加一抗，室溫孵育1小時(shí)，PBST洗滌;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，PBST充分洗滌;加入顯色液顯影攝片。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有無(wú)水乙醇浸泡過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后。4%多聚甲醛固定10分鐘;加滲透液置冰上滲透10分鐘;5%的BSA封閉1小時(shí);加一抗孵育3小時(shí)，洗滌;加熒光二抗室溫避光孵育1小時(shí)，洗滌;DAPI染核5分鐘，洗滌;封片，鏡檢拍片。

1.2.4 免疫組化 組織切片脫蠟與水化后，進(jìn)行抗原修復(fù);再用3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;用正常山羊血清封閉液封閉。滴加稀釋好的一抗，室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜，洗滌;滴加生物素標(biāo)記的二抗，洗滌;滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，洗滌;AEC顯色，在顯微鏡下觀察掌握染色程度，洗滌;蘇木素復(fù)染，洗滌;封片、鏡檢拍片。

1.2.5 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立 用活化的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體試劑盒，對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。按ELISA雙抗體夾心法測(cè)抗原的基本試驗(yàn)程序［5］，采用棋盤滴定試驗(yàn)。取純化后的數(shù)株抗體分別稀釋至 1、2、4、8 mg/ml，包被酶標(biāo)板。分別與100、500 ng/ml的NSE融合蛋白反應(yīng)，以BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照，0.2%的BSA為空白對(duì)照。然后再分別加入不同濃度酶標(biāo)抗體，稀釋度1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 和 1∶16 000。讀取 OD450 值。根據(jù)OD值和P/N值，確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的最佳搭配和工作濃度，建立ELISA檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2.6 封閉條件以及酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的優(yōu)化

以2%BSA為封閉液，BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照，0.2%BSA為空白對(duì)照。選擇37℃封閉2小時(shí)、37℃封閉4小時(shí)和4℃封閉過(guò)夜，然后進(jìn)行夾心ELISA反應(yīng)，以確定最適合封閉條件。確定最適封閉條件后，在最適的酶標(biāo)抗體濃度下，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為:37℃，30分鐘、50分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)和2小時(shí)，以確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及靈敏度的確定 取標(biāo)準(zhǔn)的NSE融合蛋白，自1 000 ng/ml開始倍比稀釋，以BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照，0.2%BSA為空白對(duì)照。進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)，重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以O(shè)D450值為縱坐標(biāo)，NSE融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 試劑盒特異性檢測(cè) 我們采用雙夾心ELISA法來(lái)檢測(cè)，分別用NSE融合蛋白、BRCA1融合蛋白、標(biāo)簽蛋白和BSA蛋白做交叉反應(yīng)來(lái)檢測(cè)雙夾心試劑盒的特異性，稀釋檢測(cè)蛋白濃度為100 ng/ml，進(jìn)行雙夾心ELISA檢測(cè)。

1.2.9 試劑盒重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè) 將我們的抗體包被好酶標(biāo)板，置于4℃儲(chǔ)存3個(gè)月，重復(fù)我們的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)。梯度稀釋蛋白分別為 1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 ng/ml，每個(gè)濃度做 3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算 P/N值，以P/N≥2.1所對(duì)應(yīng)的NSE融合蛋白的最低濃度，作為該試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)極限，與初始的最低檢測(cè)極限進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價(jià)及亞型鑒定 我們采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到穩(wěn)定分泌抗NSE抗體的雜交瘤細(xì)胞，并制備腹水，將所抽取的腹水使用以Protein G進(jìn)行親和純化，采用間接ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3號(hào)和4號(hào)抗體效價(jià)最高，達(dá)到4.2×107～6.5×107?？贵w亞類的測(cè)定結(jié)果顯示，抗體的亞型為IgG2b(圖1)。

圖1 單克隆抗體亞型鑒定Fig.1 The isotype identification of NSEmAbs

圖2 NSE單克隆抗體的WB檢測(cè)Fig.2 Western blot with our NSEmAb

2.2 NSE單克隆抗體的WB檢測(cè) 我們采用過(guò)表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)NSE單克隆抗體，將帶有HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，進(jìn)行WB檢測(cè)。結(jié)果在50 kD左右檢測(cè)到了目的蛋白NSE(圖2A)。接著我們用自制的NSE抗體，進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)源NSE蛋白的檢測(cè)，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)源NSE蛋白的表達(dá)(圖2B)，以轉(zhuǎn)染了NSE真核表達(dá)載體的293T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照指示NSE的位置。

然后我們將帶HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體梯度轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前各盤細(xì)胞換等量的細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染帶HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體DNA 分別為0、1、2、4 μg;轉(zhuǎn)染空載體的 DNA 分別為4、3、2、0 μg。轉(zhuǎn)染 36 小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，并將細(xì)胞裂解，進(jìn)行WB檢測(cè)。結(jié)果表明，我們的抗體可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到目的蛋白NSE，與細(xì)胞裂解液中NSE的位置相同，而且隨著我們轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量增加而增多(圖3)。

圖3 檢測(cè)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NSE蛋白Fig.3 Detection of secreted NSE protein in cell culture medium

圖4 內(nèi)源免疫熒光檢測(cè)NSE(×100)Fig.4 Immunofluorescence detection of NSE( ×100)

2.3 NSE抗體免疫熒光檢測(cè) WB檢測(cè)表明在許多不同癌細(xì)胞株中都有NSE的大量表達(dá)(結(jié)果未在本文顯示)，用免疫熒光方法對(duì)圖4中的3株細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在肺癌細(xì)胞H299，乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中可檢測(cè)到目的蛋白NSE，其定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在HeLa細(xì)胞中則未檢測(cè)到NSE(圖4)。

2.4 NSE抗體免疫組化檢測(cè) 取乳腺癌的組織切片，進(jìn)行染色。結(jié)果顯示:自制的NSE單克隆抗體可在乳腺癌組織中檢測(cè)到NSE蛋白，其中藍(lán)色部分為蘇木素染核的顏色，紅褐色為我們的抗體著色部位，主要位于胞漿(圖5)。

2.5 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果表明#4抗體的效價(jià)最高，因此對(duì)其進(jìn)行了HRP標(biāo)記。棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，#3抗體和酶標(biāo)#4抗體配對(duì)效果最好，#3NSE抗體包被濃度為2μg/ml，酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶4 000時(shí)效果最佳。在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 ng/ml時(shí)，#3和酶標(biāo)#4抗體各組合的P/N值見表1。

表1 棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of Checkboard ELISA

圖5 NSE單克隆抗體的免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining with NSE antibody

圖6 雙抗夾心ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of double-antibody sandwich ELISA

2.6 雙抗夾心ELISA法的優(yōu)化 在檢測(cè)蛋白濃度為300 ng/ml時(shí)，以O(shè)D450值和 P/N值為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)。不同封閉條件下的結(jié)果顯示，4℃過(guò)夜時(shí)陽(yáng)性和陰性值都稍微偏高，37℃封閉4小時(shí)和2小時(shí)差別不大。酶標(biāo)抗體在作用時(shí)間50分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)時(shí)OD值之間差異不明顯。在作用30分鐘和2小時(shí)時(shí)與其它組之間OD值差異明顯，但作用30分鐘時(shí)陽(yáng)性O(shè)D值偏低;在2小時(shí)時(shí)陰性值偏高，P/N值偏低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。最后考慮到時(shí)間和OD值問(wèn)題，我們選擇封閉條件為37℃，2小時(shí)，酶標(biāo)抗體作用時(shí)間為1小時(shí)。

圖7 雙抗夾心ELISA特異性檢測(cè)Fig.7 Specificity detection of double-antibody sandwich ELISA

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度在500～7.81 ng/ml檢測(cè)范圍內(nèi)，曲線趨近直線，線性關(guān)系最佳，以O(shè)D450值為縱坐標(biāo)，NSE融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。通過(guò)計(jì)算9個(gè)陰性孔的平均值(x)為 0.485 56，以 P/N≥2.1(P=0.101 968，N=0.048 556) 的最低 NSE 融合蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算試劑盒的最低檢測(cè)極限為8.85 ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為 0.01 007 135，吸收值x+2SD=0.058 627 35，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.321x-0.202，R2=0.996，其相對(duì)應(yīng)的濃度為 6.49 ng/ml，即該方法的檢測(cè)靈敏度為6.49 ng/ml。

2.8 試劑盒的特異性的鑒定 以檢測(cè)蛋白濃度為100 ng/ml對(duì)試劑盒的特異性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，NSE雙夾心試劑盒與NSE融合蛋白結(jié)合的OD450值，顯著高于與其它蛋白結(jié)合的OD450值(圖7)。

2.9 雙單抗夾心ELISA法的可重復(fù)性及穩(wěn)定性鑒定 用#3NSE抗體包被好的酶標(biāo)板，置于4℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，重復(fù)我們建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果回歸方程為y=0.322x-0.239，R2=0.995，最低檢測(cè)極限為 11.45 ng/ml。OD450 值與儲(chǔ)存前有一定的區(qū)別，但曲線斜率、最低檢測(cè)極限與儲(chǔ)存前變化不大，并不影響試劑盒本身的測(cè)定，說(shuō)明該試劑盒在4℃條件下至少可以保存3個(gè)月，我們的試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

3 討論

神經(jīng)元特異性烯醇化酶是目前公認(rèn)的小細(xì)胞肺癌高特異性、高敏感性的腫瘤標(biāo)志物［6，7］，并與病情的分期密切相關(guān)。因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確、方便和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，對(duì)該指標(biāo)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用具有重要意義。自從Reeve［8］于1986年成功地制作了NSE單克隆抗體以來(lái)，其在APUD腫瘤中的診斷已得到了廣泛的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)中自制的NSE單克隆抗體效價(jià)高、穩(wěn)定性好，并對(duì)這些單抗進(jìn)行了WB、IF、IHC多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)我們的抗體可特異性地識(shí)別細(xì)胞的NSE蛋白，特別是該抗體可以很好地識(shí)別分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的NSE蛋白，為將來(lái)進(jìn)行臨床血液檢測(cè)打下良好的基礎(chǔ)。同時(shí)本研究所建立的雙抗夾心ELISA定量檢測(cè)方法及可行性的初步驗(yàn)證，為相關(guān)診斷試劑盒的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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2 Schaarschmidt H，Prange H W，Reiber H et al.Neuron-specific enolase concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovascular diseases［J］.Stroke，1994;25(3):558-565.

3 邱玉華，張學(xué)光.鼠抗人sIL-6RmAb的制備及sIL-6R檢測(cè)方法的建立［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1997;13(4):58-60.

4 徐志凱.實(shí)用單克隆抗體技術(shù)［M］.西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1992:42-45.

5 鮑建芳，沈建根.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.杭州:浙江大學(xué)出版社，2006:26-28.

6 李 蓉，李 睿.肺癌腫瘤標(biāo)記物研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)· 腫瘤分冊(cè)，1996;23(2):98-103.

7 楊德昌，楊拴盈.肺癌診斷水平的現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001;24(8):450-451.

8 Reeve J L，Stewart J，Watson J V et al.Neuron specific enolase expression in carcinoma of the lung［J］.Br J Cancer，1986;53(4):519-528.