RP-HPLC 法同時測定忍冬不同變異類型花蕾中7種成分

張芳，張永清*，于曉

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355;2.山東醫(yī)藥技師學院，山東泰安271016)

金銀花為中醫(yī)臨床最常應(yīng)用的藥物之一，具有疏散風熱、清熱解毒的功效［1］，其來源為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花［2］。金銀花年需求量在2 000萬kg以上，為滿足需求，在山東、河南、河北等地廣泛種植，其中山東金銀花已有300余年的栽培歷史，經(jīng)過長期的自然選擇與人工選擇，其植株形態(tài)出現(xiàn)了分化變異，形成了數(shù)量眾多的變異類型［3-5］。這些變異類型表現(xiàn)在產(chǎn)量和質(zhì)量上均有差異［6-7］。

金銀花化學成分復雜，其主要成分包括酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類等［8-9］。近年來有關(guān)金銀花的質(zhì)量控制有采用高效液相色譜法同時測定金銀花中幾種藥效成分的報道［10-12］，但同時測定的成分種類還相對較少，本實驗采用反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)同時測定金銀花藥材中2種有機酸類(綠原酸、咖啡酸)、4種黃酮類(蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素)、1種環(huán)烯醚萜類(馬錢苷)，旨在為建立金銀花藥材質(zhì)量的多成分綜合評價體系奠定基礎(chǔ)，并且對忍冬不同變異類型花蕾質(zhì)量進行評價，為金銀花優(yōu)良變異類型的篩選、穩(wěn)定并提高金銀花藥材質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配四元梯度泵，在線脫氣機，Agilent VWD可變紫外檢測器，ChemStation色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 試劑對照品綠原酸(批號:110753-200413)、咖啡酸(批號:110885-200102)、木犀草苷(批號:111720-200905)、蘆丁(批號:100080-200707)、馬錢苷(批號:111640-200604)、金絲桃苷(批號:111521-200303)、槲皮素(批號:100081-200907)，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純，天津市四友精細化學品有限公司)，磷酸(分析純，萊陽化工實驗廠)，甲醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)。

1.3 材料山東中醫(yī)藥大學藥用植物園忍冬種質(zhì)資源圃中種植的5個不同變異類型，均為四年生植株，栽培管理措施一致。5個不同變異類型分別為①小毛花、②大毛花、③小雞爪、④大麻葉和⑤米花子。于2009年5月，在植株盛花期，分別采集其大白期花蕾，于室內(nèi)通風處陰干，粉碎，置于干燥器中備用。原藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicerae japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Aglient TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);采用梯度洗脫，流動相A為0.4%磷酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為0～18 min，A為87%;18～30 min，A為85%;30～43 min，A為85%～80%;43～48 min，A為80%;48～50 min，A為80%～70%;50～55 min，A為70%;55～65 min，A為70%～50%;檢測波長為0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm;體積流量1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣量20 μL。在上述色譜條件下，對照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of referance snbstances(A)and sample(B)

2.2 對照品溶液的制備精密稱取各對照品適量，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為綠原酸(0.56 mg/mL)、馬錢苷(13.25 μg/mL)、咖啡酸(54 μg/mL)、蘆丁(5.7 μg/mL)、金絲桃苷(5.8 μg/mL)、木犀草苷(21.5 μg/mL)、槲皮素(3.05 μg/mL)。

2.3 樣品溶液的制備取忍冬不同變異類型花蕾細粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱質(zhì)量，放置6 h，超聲處理60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，以微孔濾膜(0.45 μm)濾過即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察分別精密吸取2.2項下對照品貯備液2、4、6、10、20、40 μL，按2.1項下色譜條件進樣，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標，進行回歸計算，得回歸方程與線性關(guān)系見表1。

表1 回歸方程與線性關(guān)系

2.5 精密度考察精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定并計算各測定成分峰面積的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明各測定成分的RSD＜3%，精密度良好。

表2 7種成分的精密度、穩(wěn)定性及重復性考察(n=6)

2.6 重復性考察取同一變異類型(大毛花)樣品6份各約1.0 g，精密稱定，按照2.3項下制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，測定并計算各成分的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明RSD＜5%，方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察對變異類型2號(大毛花)的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定并計算各成分峰面積的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明RSD＜5%，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗精密稱取已知含有量的忍冬花蕾(大毛花)粉末6份，每份約1.0 g，分別加入適量混合對照品，按2.3項下制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果見表3。

表3 7種成分的回收率(n=6)

2.9 樣品測定精密稱取忍冬不同變異類型的花蕾粉末1.0 g，按2.3項下方法制備供試品溶液。準確吸取20 μL進樣，在上述色譜條件下進行測定，按外標一點法計算各供試品中相應(yīng)成分的含有量。結(jié)果見表4。

表4 忍冬不同變異類型花蕾7種成分測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇根據(jù)各測定成分的極性和溶解性，考察了采用甲醇、乙醇及50%甲醇的提取效果及所得溶液色譜峰的分離效果，結(jié)果表明，以采用50%甲醇提取所得干擾成分少，各色譜峰的分離效果好且對各測定成分提取效率高，故選用50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的優(yōu)選考察了不同梯度的乙腈－0.4%磷酸水溶液的洗脫效果，結(jié)果表明，以本實驗所用洗脫方式分離效果最好。

［12］，綠原酸的特征吸收波長為217 nm，240 nm，327 nm;蘆丁的特征吸收波長為254 nm和366 nm;木犀草苷的特征吸收波長為253 nm和355 nm;槲皮素的特征吸收波長為254 nm和368 nm。將馬錢苷、咖啡酸、金絲桃苷單對照品分別進行紫外全波長掃描，發(fā)現(xiàn)馬錢苷的特征吸收波長為240 nm;咖啡酸的特征吸收波長為254nm和323nm;金絲桃苷的特征吸收波長為215nm，257nm，359nm?？紤]到測定時干擾峰最少，故采用如下波長條件:0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm。

3.3 忍冬5個變異類型花蕾成分比較利用所建立的色譜條件對忍冬5個不同變異類型花蕾的7種主要成分進行了測定，結(jié)果表明，所測定不同樣品中綠原酸含有量最高，其次為馬錢苷和木犀草苷，槲皮素含有量最低。

《中國藥典》(2010年版)規(guī)定，金銀花中綠原酸含有量不得低于1.5%，木犀草苷含有量不得低于0.05%。所測定5個不同變異類型綠原酸均符合《中國藥典》規(guī)定，且以大麻葉含有量(3.906 7%)最高，小毛花含有量(2.244 5%)最低;不同變異類型間木犀草苷含有量差異顯著，以大毛花(0.082 5%)最高，米花子(0.040 9%)最低，達不到藥典規(guī)定標準。不同變異類型間馬錢苷含有量變異范圍在0.040 9%～0.107 9%之間，且以小毛花最高，米花子最低，最高者是最低者含有量的2.6倍左右。其次，咖啡酸、蘆丁、槲皮素的含有量，不同變異類型間均差異顯著。

以上結(jié)果顯示了金銀花栽培過程中種質(zhì)優(yōu)選對于提高藥材質(zhì)量的重要性和必要性。

3.4 小結(jié)本實驗采用RP-HPLC法同時金銀花藥材中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素、馬錢苷7種成分，方法簡便快速，結(jié)果準確，可用于金銀花的質(zhì)量控制。

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