生曬參乙醇提取物直接酶法轉(zhuǎn)化及液質(zhì)分析

喻春皓，吳潔

(1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院生物中藥與生物催化課題組，江蘇淮安223002;2.南京大學(xué)淮安高新技術(shù)研究院，江蘇淮安223005)

人參為五加科人參屬植物人參Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根，是具有4 000多年藥用歷史的名貴中藥材，在中國(guó)、韓國(guó)、日本、朝鮮及其它亞洲國(guó)家被廣泛用于滋補(bǔ)、保健和醫(yī)療。生曬參為一種商品人參，為人參根挖出后洗凈曬干的產(chǎn)品。人參皂苷(ginseng saponins)是人參的主要活性成分，已確認(rèn)的皂苷成分達(dá)30種之多，按其結(jié)構(gòu)可分為四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型皂苷和五環(huán)三萜齊墩果酸型皂苷兩個(gè)大類(lèi)［1-3］。其中達(dá)瑪烷型皂苷又分為原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷，人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2、CK、原人參二醇(protopanaxdiol，PPD)等為原人參二醇型皂苷，原人參三醇型皂苷主要有Re、Rg1、Rg2、F1、F3、Rf、20(S)-glc-Rf、Rh1、原人參三醇(protopanaxtriol，PPT)等，而人參皂苷R0為齊墩果酸型皂苷。現(xiàn)代藥理研究表明，人參藥材中存在的天然皂苷，如Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1等，口服時(shí)均為前藥，不能直接吸收進(jìn)入血液，而是在腸道菌群的生物催化轉(zhuǎn)化作用下轉(zhuǎn)化為次生皂苷Rg3、Rh2、CK、Rh1等，或者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為苷元PPD、PPT，方能進(jìn)入血液參與藥效的發(fā)揮［4］，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為極具開(kāi)發(fā)前景的抗癌和抗腫瘤藥物。

由于Rg3、Rh2、CK、Rh1等次生皂苷在人參藥材中含有量非常低，甚或根本不含有，其制備方法備受關(guān)注，主要有化學(xué)降解和生物轉(zhuǎn)化等制備方法。宋長(zhǎng)春等［5］用國(guó)產(chǎn)西洋參莖葉總皂苷直接堿催化水解制備Rh1和Rh2。陳燕萍等［6］用20(S)-原人參二醇組皂苷堿催化、熱回流制備Rh2。但化學(xué)法有污染環(huán)境、副產(chǎn)物多等諸多缺點(diǎn)。相比之下，生物酶法轉(zhuǎn)化具有專(zhuān)一性、產(chǎn)物構(gòu)象單一、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期對(duì)人參莖葉總皂苷的酶法修飾的基礎(chǔ)［7］之上，選用糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化研究，并對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行液質(zhì)分析。

1 材料

高效液相色譜儀Agilent 1100系列LC/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，包括四元梯度泵、在線(xiàn)脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、柱溫箱、電噴霧接口、四極桿質(zhì)譜、ChemStation色譜工作站、6300 Series Ion Trap LC/MS分析軟件。

生曬參飲片購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)淮陰工學(xué)院制藥工程系張海江副教授鑒定為五加科人參屬植物人參Panax ginseng的生曬干燥根。

人參皂苷R1、Rb1、Re、Rg1、Rg3、Rc、Rd、Rh2等皂苷對(duì)照品均購(gòu)自金測(cè)分析技術(shù)(天津)有限公司，其純度均為98%。纖維素酶(CE01)、果膠酶(PE05)、白酒酶(LE04)購(gòu)自天津佳益酶制劑公司，纖維素酶(CE02)、果膠酶(PE06)、酸性淀粉酶(AE03)購(gòu)自天津利華酶制劑公司，蝸牛酶(SE07)購(gòu)自上海根生生物科技有限公司。色譜純乙腈和冰乙酸均購(gòu)自美國(guó)Tedia公司，純水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜和質(zhì)譜分析條件色譜條件參考文獻(xiàn)［7］并適當(dāng)調(diào)整。色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×4.6 mm，5 μm)，以1.0 mmol/L乙酸-乙腈溶液(A相)和1.0 mmol/L乙酸-水溶液(B相)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～25 min，18%～30%A;25～40 min，30%～50%A;40～50 min，50%～70%A;50～60 min，70%～82%A;60～75 min，82%～100%A;75～77 min，100%～18%A;77～87 min，18%～18%A)，體積流量1 mL/min，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

采用負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，干燥氮?dú)怏w積流量10 L/min，干燥溫度350℃，噴霧氣體氮?dú)鈮毫?0 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛細(xì)管電壓3 500 V，掃描的質(zhì)荷比范圍100～1 400 m/z。

2.2 溶液制備

2.2.1 酶液的制備分別取7種固體酶制劑1.0 g，溶于10 mL 1.0 mmol/L pH 4.5磷酸緩沖液(其中含10%乙醇)，充分混勻，1 000 r/min低溫離心，取上清液備用。

2.2.2 生曬參乙醇提取物的制備稱(chēng)取1.0 kg生曬參飲片，用6倍量70%乙醇提取3次，合并藥液，趁熱過(guò)濾處理，減壓回流除去乙醇，濃縮至1.2L，再次過(guò)濾處理得濾液，并蒸氣滅菌處理備用，用8倍量1.0 mmol/L pH 4.5磷酸緩沖液稀釋?zhuān)洖樯鷷駞⑻崛∥颯GE。

2.2.3 參比樣品的制備準(zhǔn)確取10 mL生曬參提取物SGE，加入1.0 mL磷酸緩沖液B，在180 r/min 37℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)48 h，用11 mL水飽和的正丁醇萃取，取5 mL超純水洗正丁醇相3次，80℃減壓回收正丁醇至干得殘?jiān)?，?0 mL甲醇充分溶解殘?jiān)⒔?jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾處理為HPLC分析備用，作為參比樣品E00。

2.2.4 酶法轉(zhuǎn)化樣品的制備準(zhǔn)確取10 mL生曬參提取物SGE，分別加入2.2.1項(xiàng)中的酶液1 mL，其余處理同2.2.3項(xiàng)，得系列酶法轉(zhuǎn)化樣品。

2.2.5 對(duì)照品皂苷溶液制備分別準(zhǔn)確稱(chēng)取8種皂苷對(duì)照品，用甲醇配制成單標(biāo)皂苷溶液，用作定性分析。準(zhǔn)確稱(chēng)取8種皂苷對(duì)照品一同置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾處理，其最終質(zhì)量濃度為:NR1，0.543 5 mg/mL;Rb1，0.652 2 mg/mL;Rc，0.179 3 mg/mL;Rd，0.451 1 mg/mL;Re，0.157 6 mg/mL;Rg1，0.402 2 mg/mL;Rg3，0.141 3 mg/mL;Rh2，0.592 4 mg/mL。即得8種皂苷的混合對(duì)照品溶液，記為GMS混標(biāo)溶液。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察取2.2.5項(xiàng)中配制的GMS混標(biāo)溶液，取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10、15 μL等不同的進(jìn)樣體積，按照2.2.1項(xiàng)中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得8種皂苷的對(duì)照品曲線(xiàn)，見(jiàn)表1。

表1 8種皂苷活性成分的對(duì)照品曲線(xiàn)Tab.1 Standard curves of eight ginsenosides

2.4 方法學(xué)考察參考文獻(xiàn)［7］，對(duì)所建立測(cè)定方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等考察分析，結(jié)果表明所測(cè)試項(xiàng)均符合要求。

2.5 數(shù)據(jù)處理單體皂苷含有量=樣品溶液中各單體皂苷的質(zhì)量/10 mL生曬參提取物相當(dāng)?shù)纳鷷駞①|(zhì)量×100%?？偤辛繛闃悠分袡z出的Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd等5種皂苷含有量之和?？傓D(zhuǎn)化能力=(未加酶樣品中皂苷總含量－轉(zhuǎn)化樣品中5種皂苷總含有量)/未加酶樣品中皂苷總含有量×100%。

2.6 結(jié)果

2.6.1 不同糖苷酶制劑轉(zhuǎn)化生曬參乙醇提取物的液相色譜分析按2.2.4項(xiàng)制備樣品，考察不同糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物的轉(zhuǎn)化影響，結(jié)果見(jiàn)圖1，其主要特征色譜峰面積變化見(jiàn)表2。7種酶制劑對(duì)8種皂苷的含有量變化影響見(jiàn)表3，其中6種糖苷酶制劑的總轉(zhuǎn)化能力順序?yàn)镾E07=PE05＞PE06＞LE04＞CE02＞CE01，而AE03轉(zhuǎn)化時(shí)因提取物中的其它皂苷被轉(zhuǎn)化成Rc和Rd使得計(jì)算的5種皂苷總含有量高于未加酶樣。其中蝸牛酶SE07對(duì)生曬參乙醇提取物中天然皂苷的轉(zhuǎn)化作用較強(qiáng)，轉(zhuǎn)化生成了系列新化合物。

圖1 糖苷酶制劑轉(zhuǎn)化生曬參乙醇提取物后的色譜圖譜比較Fig.1 HPLC chromatograph of alcohol extracts from sun-dried Panax ginseng converted with glycosidase

2.6.2 液質(zhì)聯(lián)用法色譜峰指認(rèn)采用負(fù)離子模式［8-10］按2.1項(xiàng)對(duì)蝸牛酶SE07轉(zhuǎn)化樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，并與未加酶樣品(E00)及混標(biāo)溶液(GMS)的液質(zhì)分析圖譜比較，對(duì)各保留時(shí)間下物質(zhì)峰進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC分析比較了7種糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物中天然皂苷成分的轉(zhuǎn)化能力，與未加酶樣品比較7種糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物中的天然皂苷成分均有一定的轉(zhuǎn)化作用，但各有側(cè)重。與對(duì)照品比對(duì)分析，生曬參乙醇提取物經(jīng)纖維素酶CE01、CE02及酸性淀粉酶AE03催化反應(yīng)48 h后，Rb1和Rc分子上1，6-糖苷鍵均可被催化水解轉(zhuǎn)化為Rd。經(jīng)白酒酶LE04、果膠酶PE05和PE06、蝸牛酶SE07催化反應(yīng)48 h后，可催化水解Rb1和Rc分子中的1，6-糖苷鍵轉(zhuǎn)化成Rd，也可催化水解Rd中的糖苷鍵，均在Rh2峰緊鄰處產(chǎn)生了一個(gè)強(qiáng)峰，其中酶PE05和SE07對(duì)Rb1轉(zhuǎn)化較為徹底。由表3和4可知，生曬參乙醇提取物經(jīng)蝸牛酶處理后，與未經(jīng)酶處理相比，Rb1消失殆盡，Rc和Rd均降低，而在保留時(shí)間41.6 min和50.9 min分別產(chǎn)生了與Rg3(783［M－H］－1)和Rh2(621［M－H］－1)的同分異構(gòu)體。文獻(xiàn)［11］數(shù)據(jù)比對(duì)分析表明，HPLC及LC/MS分析保留時(shí)間為41.6 min和50.9 min分別為人參皂苷F2(783［M－H］－1)和CK(621［M－H］－1)?？赏茰y(cè)生曬參中天然皂

苷Rb1和Rc的酶法轉(zhuǎn)化途徑為，Rb1或Rc→Rd→F2→CK。

表2 糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物轉(zhuǎn)化液的液相色譜特征峰面積的影響Tab.2 Effects of glycosidase on peak area of active components in converted solutions

表3 糖苷酶制劑對(duì)生曬參乙醇提取物轉(zhuǎn)化液中8種皂苷的影響Tab.3 Effects of glycosidase on concentration of eight ginsenosides in converted solutions

表4 混標(biāo)溶液(GMS)、未加酶(E00)及蝸牛酶(SE07)轉(zhuǎn)化樣品的液質(zhì)分析及峰指認(rèn)Tab.4 HPLC-UV-ESI-MS identification results of GMS，sample E00 and SE07

天然人參皂苷的轉(zhuǎn)化方法主要有化學(xué)轉(zhuǎn)化、微生物轉(zhuǎn)化、酶法轉(zhuǎn)化等方法［12］。酸水解轉(zhuǎn)化有完全水解和部分水解，但皂苷的C-20位的構(gòu)型極易受酸的影響轉(zhuǎn)位，發(fā)生互變異構(gòu)現(xiàn)象，結(jié)果造成次生皂苷活性降低。和酸水解比較，堿水解中間產(chǎn)物較少，水解比較完全，C-20位異構(gòu)化程度低，但規(guī)?；a(chǎn)的環(huán)境污染嚴(yán)重。微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件相對(duì)要求較高，其規(guī)?；瘮U(kuò)大上可控性要求會(huì)更高。酶法轉(zhuǎn)化為選擇性水解反應(yīng)，不同種類(lèi)的酶可作用于不同構(gòu)型和不同的糖苷鍵，可達(dá)到定向水解的目的。某些高活性特殊次生皂苷(如CK)分子很難通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法獲得，而通過(guò)酶法轉(zhuǎn)化較為容易，體現(xiàn)了酶法轉(zhuǎn)化的專(zhuān)一性、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用的糖苷酶制劑是多種酶的混合物，因此對(duì)生曬參乙醇提取中天然皂苷就夠會(huì)有不同的選擇性。該研究結(jié)果為利用酶制劑直接轉(zhuǎn)化生曬參乙醇提取物制備高活性次生皂苷提供可靠的依據(jù)，具有較高的利用前景。

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