反相高效液相色譜法測定益心寧神片中五味子醇甲和五味子乙素

王曉嬌，郭偉英

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121001)

益心寧神片原方出自《金匱要略》，《傷寒論》。本方由五味子，靈芝，人參莖葉總皂苷和藤合歡組成，可補氣生津，養(yǎng)心安神，臨床用于心悸氣短，多夢失眠，記憶力減退，神經(jīng)衰弱等癥。其中主要成分五味子中的木脂素成分對機體存在廣泛的作用，涉及消化系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)等。在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用中，木脂素中的五味子醇甲能顯著延長小鼠戊巴比妥鈉及巴比妥鈉的睡眠時間，減少小鼠自主活動［1］。木脂素中的五味子乙素可明顯延長小鼠對戊巴比妥鈉或環(huán)己巴比妥鈉的睡眠時間，而且對小鼠的睡眠時間有先延長后縮短的雙向作用［2］。益心寧神片是2010年剛收入《中國藥典》的中成藥，然而，目前《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對人參莖葉總皂苷中的成分進(jìn)行了測定。多種活性組分定量分析是中藥質(zhì)量控制的發(fā)展必然，故本實驗建立了以高效液相色譜法測定益心寧神片中五味子醇甲和五味子乙素的方法，本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡單，便于應(yīng)用，對于進(jìn)一步提升益心寧神片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，深入研究其活性及作用機理具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器日立L-2000系列高效液相色譜儀;AL-204型精密電子天平［梅特勒-托利多(上海)有限公司］;KQ-100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑五味子醇甲對照品(批號:10030202)和五味子乙素對照品(批號:11050601)(成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度≥98.0%);益心寧神片購自本溪某藥房(批號:110701，110611，110504);甲醇為市售色譜純;水為自制三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備分別精密稱取減壓干燥至恒質(zhì)量的五味子醇甲，五味子乙素對照品10.000 0 mg，9.999 8 mg置于5 mL量瓶中，用色譜純甲醇溶解并稀釋至刻度，定容制成含五味子醇甲，五味子乙素各2.0 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備取本品一片，去除薄膜衣，研細(xì)，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加色譜純甲醇溶解。密塞，超聲兩次，每次40 min，合并提取液，放冷，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到濃溶液后，用色譜純甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3 陰性對照液的制備按處方比例及制備工藝制備缺五味子陰性對照品，并按2.2項供試品溶液的制備方法制成陰性對照液。

2.4 色譜條件與方法學(xué)考察色譜柱為Hypersil BDS C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動相為甲醇-水(65∶35)，體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，五味子醇甲和五味子乙素與樣品中其他成分均達(dá)到完全分離，且與臨近色譜峰分離度＞1.5，理論塔板數(shù)按五味子醇甲和五味子乙素計算均不低于3 000，對照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、益心寧神片樣品(B)及缺五味子的陰性樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，Yixin Ningshen Tablets(B)and negative sample without Schisandrae chinensin Frustus(C)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配置對照品系列溶液，使混合對照品溶液中五味子醇甲和五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.025 mg/mL，依次進(jìn)樣20 μL。按上述色譜條件測得各質(zhì)量濃度下的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以五味子醇甲和五味子乙素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得五味子醇甲和五味子乙素的回歸方程分別為:Y=1 102 625.000 9X－199.714 0，r=1.000 0;Y=2 635 670.830 5X+2 480 9.150 2，r=0.999 9。結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子乙素的進(jìn)樣量在0.5～20 μg時，與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗精密吸取0.025 mg/mL對照品混合溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。分別計算五味子醇甲和五味子乙素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，RSD分別為1.00%，1.37%。

2.7 重復(fù)性實驗取同一批號(批號:110701)樣品，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算含量。結(jié)果五味子醇甲含有量的平均值為5.094 3 mg/片，RSD為1.632 2%;五味子乙素含有量的平均值為0.590 3 mg/片，RSD為1.877 1%。

2.8 穩(wěn)定性試驗供試品溶液在0、2、4、6、8、10 h分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為1.158 6%和1.147 2%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實驗分別準(zhǔn)確稱取0.52 g已知含有量的益心寧神片藥粉(批號:110701)，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，加入適量色譜純甲醇使溶解，超聲兩次，每次40 min，放冷至室溫，準(zhǔn)確加入五味子醇甲和五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用色譜純甲醇定容，經(jīng)(0.45 μm)濾膜過濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定結(jié)果，計算含有量。結(jié)果五味子醇甲的平均回收率(n=6)為101.01%，RSD為1.64%;五味子乙素的平均回收率(n=6)為101.57%，RSD為2.20%?；厥章试囼灲Y(jié)果見表1。

表1 五味子醇甲和五味子乙素加樣回收率結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of schisandrin and γschisandrin(n=6)

2.10 樣品的測定按2.2項下方法制備3批樣品的益心寧神片供試品溶液，在上述色譜條件下測定峰面積，外標(biāo)一點法計算樣品中五味子醇甲和五味子乙素的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

3 討論

3.1 本品由五味子，藤合歡，人參莖葉總皂苷和靈芝四味中藥制備而成，《中國藥典》［3］中僅對人參莖葉總皂苷中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進(jìn)行測定，不利于多方位的控制益心寧神片的質(zhì)量。五味子(酒制)有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用［4］，而其中的五味子醇甲和五味子乙素的鎮(zhèn)靜催眠作用顯著。所以本實驗選用五味子中五味子醇甲和五味子乙素作為定量指標(biāo)，用RP-HPLC法測定其含有量，結(jié)果陰性無干擾，且方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，專屬性強。

3.2 測定前應(yīng)注意好樣品的前處理，曾經(jīng)采用加熱回流，滲漉，超聲提取和索氏提取，對樣品進(jìn)行處理，結(jié)果表明五味子中木脂素成分以超聲提取較為完全［5-7］，且方法簡單易行。本實驗在制備供試品時曾比較不同提取溶劑(100%甲醇，70%甲醇，100%乙醇，70%乙醇)和不同提取時間(30 min、40 min、50 min)對所得含有量的影響，以100%甲醇為提取溶劑，連續(xù)兩次分別超聲提取40 min時所得含有量最大，故在此條件下提取供試品［8-11］。

3.3 本實驗比較過不同比例流動相(75∶25、70∶30、65∶35、60∶40)，體積流量(0.8 mL/min，1.0 mL/min)和溫度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)對出峰時間，分離度，雜質(zhì)出現(xiàn)情況和峰型的影響，最后確定使用流動相比例為(65∶35)，1.0 mL/min，柱溫為40℃，在該條件下，各峰與雜質(zhì)峰分離良好，峰型對稱而尖銳［12-13］。

3.4 五味子醇甲和五味子乙素在190 nm到254 nm之間均有強信號強度，但經(jīng)比較在210 nm處時，五味子醇甲和五味子乙素的信號強度適中，適合同時測定。

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