山楂總黃酮的逆流提取研究

戴曉燕，余陳歡，吳巧鳳*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053;2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310013)

山楂系薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實(shí)，具有健胃消食，行氣散瘀之功效，屬于我國藥食同源的傳統(tǒng)中藥材。現(xiàn)代研究表明，黃酮類物質(zhì)為山楂的主要活性成分［1］，含有量較高［2］，能夠起到助消化［3］、降血脂［4］、保肝［5］、強(qiáng)心［6］及抗氧化［7］等作用。山楂在醫(yī)用藥品及保健品方面的開發(fā)利用較頻繁，它的價(jià)值往往體現(xiàn)于其加工產(chǎn)品的附加值上，故加強(qiáng)山楂有效物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化提取十分必要。目前，山楂黃酮的提取方法包括有熱回流法、水煎法及滲漉法等方法，其中以熱回流法最為常用，但這些方法存在著提取率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大、后續(xù)工段能耗大等缺點(diǎn)［8］。逆流提取是一種基于傳統(tǒng)單罐提取發(fā)展起來的新型提取方法，研究表明，該方法可確保藥材與溶劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，可大大增加提取效率［9］。本研究擬采用三級(jí)逆流提取、三效逆流提取工藝模型的實(shí)驗(yàn)室模擬方法及常規(guī)回流提取方法提取山楂總黃酮，并客觀地將3種方法進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，確定山楂總黃酮的最適提取方法，以期為山楂黃酮相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV—2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，UV probe紫外工作站;HH—S型恒溫水浴鍋(鞏義市瑛峪予華儀器廠);0412—1型高速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);DHG—9035熱風(fēng)循環(huán)烘箱(上海林頻儀器設(shè)備有限公司)，WND—200A型高速中藥粉碎機(jī)(上海微型電機(jī)廠)。

1.2 試藥蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100226)購自中國藥品生物制品檢定所;山楂飲片(產(chǎn)地:山東;批號(hào):111118)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)俞冰副教授鑒定屬薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實(shí);所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同提取方法提取山楂總黃酮

2.1.1 三級(jí)逆流提取精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的山楂飲片3份，各10.0 g，分別置于3個(gè)圓底燒瓶中，以60%乙醇為提取溶媒，按照三級(jí)逆流提取工藝進(jìn)行提取。具體方法如圖1所示，第1階段山楂飲片被提取3次，每次均加入新鮮溶媒50 mL，得溶液E1-1、E1-2、E1-3，其中E1-1儲(chǔ)存。第2階段提取，溶液E1-2、E1-3分別作為第1次、第2次提取的溶媒，得溶液E2-1、E2-2，其中E2-1儲(chǔ)存;第3次則采用新鮮溶媒提取第2次所得藥渣，得溶液E2-3。第3階段，溶液E2-2、E2-3分別作為第1、第2次提取的溶媒，得溶液E3-1、E3-2均儲(chǔ)存;第3次采用新鮮溶媒提取第2次所得藥渣，得溶液E3-3儲(chǔ)存。每階段每次提取溫度為80℃，提取時(shí)間20 min。最后合并各所得溶液，放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗(yàn)3次。

圖1 三級(jí)逆流提取過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of three-stage countercurrent extraction

2.1.2 三效逆流提取平行精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的山楂飲片5份，各6.0 g，分別置于5個(gè)圓底燒瓶中以60%乙醇為提取溶媒，按照三效逆流提取工藝進(jìn)行提取。具體提取方法如圖2所示，方框中1-12分別代表第1至12提取步驟，方框上方符號(hào)代表每步驟所加入的溶媒，左側(cè)符號(hào)代表被提取物，如:步驟1為加入新鮮提取溶媒與新鮮飲片進(jìn)行提取;步驟2為新鮮提取溶媒與步驟1所得藥渣進(jìn)行提取，依此類推。每步提取溫度為80℃，提取時(shí)間為15 min，凡需加入新鮮溶媒時(shí)其加入體積均為30 mL。最后合并各所得溶液，放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗(yàn)3次。

圖2 三效逆流提取過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of three-effect countercurrent extraction

2.1.3 常規(guī)回流提取精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的山楂飲片30 g，置圓底燒瓶中，加入60%乙醇溶液300 mL，80℃熱回流5 h，傾出放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗(yàn)3次。

2.2 總黃酮的定量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品5.58 mg置于25 mL量瓶中，以60%乙醇稀釋至刻度線，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.223 2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備量定2.1項(xiàng)下各最終提取液體積，均量取120 mL提取液濃縮至50 mL，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速高速離心10 min，傾出上清液并將濃縮液用60%乙醇溶液定容成100 mL，備用。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇精密吸取對(duì)照品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后再加入10%NaOH溶液10 mL，搖勻后用60%乙醇溶液稀釋至刻度線，放置15 min后，在波長(zhǎng)400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，每隔10 nm測(cè)定吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液在510 nm處的吸光度值最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇510 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL的量瓶中，同2.2.3項(xiàng)下方法顯色后，作同行試劑空白對(duì)照測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)Y，以蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=13.064X－0.022 9(R=0.999 6)。結(jié)果表明，蘆丁在0.004 464～0.044 64 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液2.0 mL，依2.2.3項(xiàng)中方法顯色后于510 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果RSD為1.67%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取山楂飲片，依照2.1項(xiàng)下各方法提取，并按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6份，同2.2.3項(xiàng)中方法顯色后分別測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD分別為1.15%、0.74%、0.97%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液0.3 mL，依2.2.3項(xiàng)下方法顯色后，每隔5 min測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為1.43%，表明溶液在30 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。因此，吸光度的測(cè)定應(yīng)控制在30 min以內(nèi)進(jìn)行。

另精密吸取0.3 mL供試品溶液分別于0、1、2、3、4、5、6 h后，按2.2.3項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為2.28%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn)適量量取已知總黃酮量的山楂提取液9份，分別精密加入相當(dāng)于溶液中總黃酮含有量80%、100%及120%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并依2.2.3項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.68%，RSD為1.60%，符合要求，見表1。

2.2.9 山楂總黃酮提取得率精密量取供試品溶液0.2 mL，依2.2.3項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算總黃酮含有量，并進(jìn)一步算得提取得率。

2.3 不同提取方法的比較為客觀地比較不同提取方法，對(duì)上述各提取方法的飲片用量、溶劑用量、總提取時(shí)間及提取得率進(jìn)行了羅列，見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 不同提取方法藥材用量、溶劑用量、提取時(shí)間及提取得率Tab.2 Usage，solvent usage，extract time and extract yield of different extract methods

由表2可知，三級(jí)逆流、三效逆流提取方法與常規(guī)回流提取方法相比，三者的總黃酮提取得率相當(dāng)，但前兩種提取方法的溶劑消耗量明顯下降，其中三效逆流提取的溶劑消耗量?jī)H為常規(guī)回流提取方法的1/2;較之常規(guī)回流提取，兩種逆流提取方法的提取時(shí)間也大大縮短，為常規(guī)回流提取方法的3/5。表明逆流提取方法具有提取效果好、節(jié)省溶劑、節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本以及縮短提取時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，將逆流提取方法引入山楂黃酮類物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室提取或推廣至山楂黃酮相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)均有可助于工作效率的大幅度提高。

為進(jìn)一步說明逆流提取方法具有較高的提取效率，另取山楂飲片3份，各10 g，分別采用三級(jí)逆流、三效逆流及常規(guī)回流提取方法，以60%乙醇為溶劑，控制三者的總提取時(shí)間均為1 h，總?cè)軇┯昧烤鶠?00 mL，提取溫度均為80℃，提取山楂中總黃酮。提取結(jié)束放涼后，取各提取液20 mL，以60%乙醇定容至50 mL量瓶中。采集用不同方法提取并定容后所得溶液的圖像(見圖3)，運(yùn)用Imagepro Plus 6.0(專業(yè)圖像分析軟件6.0)對(duì)各圖像進(jìn)行參數(shù)分析。

結(jié)果各溶液圖像的像素密度大小依次為三效逆流(132.67)＞三級(jí)逆流(115.66)＞常規(guī)回流(92.67)，表明在相同的提取條件下，逆流提取能更有效地使藥材中的溶質(zhì)擴(kuò)散至溶劑中。

圖3 不同提取方法所得提取液圖像Fig.3 Solution images of different extract methods

3 討論

藥材有效成分的提取過程是溶質(zhì)從固相藥材高濃度向液相低濃度滲透的傳質(zhì)過程。有效成分的提取浸出擴(kuò)散力來源于提取溶媒與固相藥材組織內(nèi)有效成分的濃度差，濃度差越大，擴(kuò)散傳質(zhì)的動(dòng)力越大，浸出速度越快，有效成分浸出率越大［10］。逆流提取方法可始終保持兩相間較大的濃度梯度，從而維持較好的提取推動(dòng)力來達(dá)到提高提取效率的目的。本實(shí)驗(yàn)分別采用了傳統(tǒng)回流提取與兩種逆流提取方法來提取山楂中總黃酮，結(jié)果顯示逆流提取可大大減少提取的溶劑用量和時(shí)間，在節(jié)省提取成本的同時(shí)也保證了提取的質(zhì)量，且對(duì)提取設(shè)備無過高要求，既適合推廣應(yīng)用于山楂黃酮類相關(guān)藥品、食品的生產(chǎn)也適用于實(shí)驗(yàn)室的中藥成分提取。此外，考慮實(shí)際生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)的方便性及可操作性，與三效逆流相比之下，三級(jí)逆流提取的操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)便，亦能較好的提高提取效率，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

［1］吳世杰，李秋津，肖學(xué)鳳，等.山楂化學(xué)成分及藥理作用的研究［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33(4):316-319.

［2］蔣福勇.山楂資源的開發(fā)與利用簡(jiǎn)述［J］.南方園藝，2011，22(1):56-58.

［3］劉家蘭，徐曉玉.山楂的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40(S1):63-66.

［4］楊宇杰，林靜，王春民，等.山楂葉總黃酮對(duì)大鼠高脂血癥早期干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，2008，39(12):1848-1850.

［5］李晶，馮五金.生山楂、澤瀉、莪術(shù)對(duì)大鼠脂肪肝的影響及其交互作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.山西中藥，2006，22(3):57-59.

［6］鞠曉云，方泰惠，張文通.山楂葉總黃酮凍干粉對(duì)麻醉犬冠脈結(jié)扎所致心肌梗死的影響［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(6):381-383.

［7］Liu T X，Cao Y N，Zhao M M.Extraction optimization，purification and antioxidant activity of procyanidins from hawthorn(C.pinnatifida Bge.var.major)fruits［J］.Food Chem，2010，119(4):1656-1662.

［8］柳唐鏡，張棵，劉國英，等.中國山楂屬植物資源研究和利用現(xiàn)狀［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42(8):847-852.

［9］Gaile A A，Saifidinov B M，Kolesov V V，Koldobskaya L L.Multistep countercurrent extraction of organic sulfur compounds and arenes from the high-sulfur diesel fraction［J］.Russian J Applied Chem，2010，83(3):473-476.

［10］韓平，張燕，何榮.逆流提取工藝在中藥提取中的應(yīng)用［J］.西部醫(yī)藥，2009，21(2):284-285.