重組病毒載體研究進(jìn)展＊

王培園，李 結(jié)，朱興全，楊桂連，袁子國(guó)

重組病毒載體是當(dāng)今病毒基因工程研究的熱點(diǎn)之一。載體是供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或復(fù)制的運(yùn)載工具。近年來(lái)，重組病毒載體為由病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)提供了更為安全可靠的載體渠道，研制能高效轉(zhuǎn)移基因、表達(dá)高度組織特異性、精確控制表達(dá)的病毒載體迫在眉睫。利用病毒載體可治療一些特殊疾病，同時(shí)探索病毒載體所面臨的安全性和毒性問(wèn)題［1］。目前研究最多的主要有腺病毒載體、偽狂犬病毒載體、慢病毒載體、雞痘病毒載體、人5型腺病毒載體等。理想的病毒載體在基因治療、疫苗研制、疫病防控等領(lǐng)域的貢獻(xiàn)不可估量。本文對(duì)上述5種病毒載體的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為開(kāi)發(fā)出更安全、更有效的重組病毒載體提供參考。

1 腺病毒載體

腺病毒（Adenovirus，Adv）屬于腺病毒科，線狀、無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小約36kb，由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體構(gòu)成二十面體病毒殼體。Adv于1953年被病毒學(xué)家發(fā)現(xiàn)，此后不斷進(jìn)行深入研究，現(xiàn)已成為最有效的基因表達(dá)載體之一［2］。

腺病毒具有宿主范圍廣、不整合入宿主細(xì)胞內(nèi)、插入外源基因大（37kb）、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因且表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為表達(dá)和傳遞治療基因的主要候選者。而腺病毒感染的廣泛性，同時(shí)也決定了其缺乏靶向性，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間短，并限制其反復(fù)應(yīng)用。由此可見(jiàn)，Adv載體的免疫原性、安全性和靶向性已成為其構(gòu)建策略中改造的重點(diǎn)。

構(gòu)建新一代腺病毒載體有如下目標(biāo)：（1）降低重組腺病毒載體產(chǎn)生的機(jī)體抗原特異性免疫反應(yīng)，在WT／CS－GFP的衣殼蛋白中插入一個(gè)PyCS－B的抗原表位，衣殼修飾性腺病毒研制的多疫苗接種后，可大幅提高小鼠的抗瘧疾水平，使得腺病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)［3］。Elizabeth等系統(tǒng)地探討TLR信號(hào)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和替代型與普通肌肉注射免疫小鼠產(chǎn)生重組腺病毒載體，研究表明MyD88的依賴的信號(hào)通路能有效改變其免疫原性［4］。（2）增強(qiáng)腺病毒靶向性，可更換病毒外殼采用不同類型血清型獲得；消除AD載體與CAR結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的通路；能與靶細(xì)胞表面特異性受體選現(xiàn)有的腺病毒大致可分為3代。第1代腺病毒載體主要通過(guò)去除E1、E3區(qū)而獲得，可轉(zhuǎn)染分擇性結(jié)合。（3）采用脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)構(gòu)建人VEGF基因rAD載體，極大提高了轉(zhuǎn)染效率［5］。分裂期細(xì)胞和靜止期細(xì)胞。但外源基因表達(dá)水平低，易誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；第2代腺病毒載體進(jìn)一步去除了部分或全部的E2基因或E4基因，消除了產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒的可能性，比第一代具有更低的免疫原性和更大的載體容量；第3代腺病毒載體又稱輔助病毒依賴型腺病毒載體（Helper－dependent adenovirus，HD－Ad）［6］，僅含有反向末端重復(fù)序列（ITRs）和包裝信號(hào)（Ψ），載體容量達(dá)37kb，細(xì)胞毒性和免疫原性大幅減弱，而目的基因的表達(dá)時(shí)間則大大延長(zhǎng)。然而，它需要有輔助病毒和互補(bǔ)細(xì)胞系才能夠包裝產(chǎn)生病毒粒子，即所謂的空殼載體，且輔助病毒產(chǎn)量很高，分離困難，與重組腺病毒產(chǎn)量比例為1∶1。因此，對(duì)第3代腺病毒進(jìn)行改良研究，生產(chǎn)出安全高效，靶向性強(qiáng)，表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)并可調(diào)控的新一代腺病毒載體至關(guān)重要，其臨床應(yīng)用前景將更為廣闊。

腺病毒載體在疾病的基因治療、活載體疫苗、體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)其治癌癥、遺傳性疾病、傳染病等均有相關(guān)報(bào)道。Jeroen等總結(jié)了腺病毒載體在前列腺癌的治療進(jìn)展，經(jīng)各種臨床前研究證明了腺病毒介導(dǎo)的基因治療和溶瘤病毒治療可構(gòu)成新的治療策略［7］。Ad5F35表達(dá)載體的綠色熒光蛋白標(biāo)記的CFTR能通過(guò)頂面有效轉(zhuǎn)導(dǎo)囊性纖維化患者的重組呼吸道上皮細(xì)胞，在相對(duì)低載體劑量的狀況下恢復(fù)氯離子通道功能，并可呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的綠色熒光蛋白－CFTR達(dá)到數(shù)周［8］。另有報(bào)道表明，DNA質(zhì)粒和Ad5型腺病毒在誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的同時(shí)，亦可產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）免疫反應(yīng)［9］。

Ad5型Adv已用于HIV－1型疫苗株的構(gòu)建，為人類傳染病的治療提供基礎(chǔ)。王長(zhǎng)昇等［10］采用AdMax包裝系統(tǒng)，將外源基因的穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒，利用Cre／loxP重組酶系統(tǒng)，脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒Ad5－h(huán)BDNF－EGFP，提高重組效率，具有一定的創(chuàng)新性。另外還可介導(dǎo)家族性高膽固醇血癥、Ⅸ因子基因轉(zhuǎn)移治療血友病B等其他遺傳病的治療。人們對(duì)于在小鼠及犬模型中血友病A和B型出血素質(zhì)的穩(wěn)定校正進(jìn)行研究，結(jié)論顯示有良好的治療效果［11］。研究發(fā)現(xiàn) HD－AD在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有持續(xù)高水平的表達(dá)，宿主的免疫炎癥反應(yīng)較低，治療基因的表達(dá)水平比內(nèi)源性表達(dá)高3倍，提示其可較好地應(yīng)用于血管疾病的治療［12］。

2 偽狂犬病病毒載體

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科A型皰疹病毒亞科，豬皰疹病毒Ⅰ型。PRV含有11種糖蛋白即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM 和gN。其中g(shù)B、gD、gH、gL、gK是PRV病毒體外增殖所必需的糖蛋白；gC、gE、gG、gI和gM是非必需的糖蛋白，決定毒力因素的因子，可以用作外源基因的插入位點(diǎn)。另外，與PRV毒力有關(guān)的基因如胸苷激酶（TK）基因、核苷酸還原酶（RR）基因、蛋白激酶（PK）基因、gE基因等。TK基因缺失不影響病毒的增殖，卻能顯著降低病毒毒力，是外源基因插入的首選位點(diǎn)，TK基因缺失的PRV毒株被廣泛地應(yīng)用到PRV基因缺失疫苗的研究中。因此，在PRV病毒復(fù)制的非必需區(qū)插入外源基因或缺失該區(qū)部分基因（gE、gI、gG、gC、TK等），從而研制出安全性更高的基因缺失活疫苗。

偽狂犬病毒以其特殊的基因組結(jié)構(gòu)、宿主的廣泛性和生物安全性成為研制活載體疫苗的重要載體工具。PRV作載體有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如外源基因容量大、安全性好、免疫期長(zhǎng)、宿主范圍廣、低成本、人類對(duì)PRV沒(méi)有易感性等。且PRV載體可同時(shí)插入多個(gè)外源基因，因而能夠一針多防、提高免疫效率［13］。然而，PRV載體亦存在一些問(wèn)題，如外源基因表達(dá)水平較低需強(qiáng)啟動(dòng)子，重組病毒的篩選方法還不夠成熟。

病毒復(fù)制非必需區(qū)的克隆與篩選是理想的重組病毒的構(gòu)建的首要因素。由于外源基因只有插入到病毒的復(fù)制非必需區(qū)才有可能實(shí)現(xiàn)蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，而且載體表達(dá)外源基因的量直接受其在載體中的插入位點(diǎn)的制約，因此非必需區(qū)的獲得是構(gòu)建重組病毒的先決條件。就偽狂犬病毒而言，復(fù)制非必需區(qū)TK、gG、gE基因是目前應(yīng)用較多的同源序列［14］。袁子國(guó)等［15］構(gòu)建以 Prv Bartha－K61株為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組活載體疫苗，結(jié)果表明重組病毒的滴度增高，外源基因在細(xì)胞內(nèi)得到了有效的表達(dá)，并具有良好的免疫反應(yīng)原性和遺傳穩(wěn)定性。Zhang等［16］構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒衣殼前體肽P12A和非結(jié)構(gòu)蛋白3C的偽狂犬病毒載體疫苗（PRV－P12A3C），結(jié)構(gòu)表明部分仔豬的臨床癥狀減輕，囊泡出現(xiàn)延遲。

3 慢病毒載體

慢病毒（Lentivirus）屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為二倍體RNA病毒。作為逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員，不僅包含gag、pol、env 3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，而且有4個(gè)輔助基因vif、vpr、nef、vpu以及2個(gè)調(diào)控基因tat和rev。其中g(shù)ag、pol、env分別編碼病毒的核心蛋白、病毒復(fù)制所需的酶類及病毒包膜糖蛋白；Rev編碼的蛋白調(diào)節(jié)gag、pol、env的表達(dá)水平，tat編碼的蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄的控制。4個(gè)輔助基因編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染。

慢病毒載體以HIV－1為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)。其構(gòu)建原理就是將HIV－1基因組中的順式作用元件和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV－1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白質(zhì)；載體成分與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV－1順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。

慢病毒宿主范圍廣，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，且可感染分裂細(xì)胞及神經(jīng)元、肌細(xì)胞等多種類型非分裂細(xì)胞，更為重要的是該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。慢病毒載體通過(guò)去除慢病毒基因組中復(fù)制所需的基因，以治療性基因和選擇標(biāo)記物取代構(gòu)建而成，是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中備受關(guān)注的真核生物基因轉(zhuǎn)移載體。

隨著對(duì)慢病毒載體系統(tǒng)研究的不斷深入，相關(guān)研究不僅僅集中在以HIV－1為基礎(chǔ)的慢病毒載體上，還包括貓免疫缺陷病毒、HIV－1和2型（HIV－2／SIV）、復(fù)制缺陷型慢病毒載體、自體失活慢病毒載體以及選擇增殖型載體等。慢病毒的改造主要包括最小輔助包裝元件、去掉附加基因或調(diào)節(jié)基因等。第1代慢病毒載體（Naldini等構(gòu)建，1996）由載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒組成，載體質(zhì)粒負(fù)責(zé)裝載外源基因，刪除了gag、pol、env等基因，但保留有5′和3′LTR、Psi位點(diǎn)、Rev反應(yīng)元件，載體容量增大，效率更高。第2代慢病毒載體（Zufferey等構(gòu)建，1997）在此基礎(chǔ)上，去除包裝質(zhì)粒上的vif、vpr和nef3個(gè)輔助基因而獲得。三質(zhì)粒系統(tǒng)極大程度降低了序列重疊的概率，使有復(fù)制能力的病毒產(chǎn)生受到抑制。而第3代慢病毒載體則在三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)減少HIV－1包裝結(jié)構(gòu)中的序列同源性構(gòu)建四質(zhì)粒系統(tǒng)獲得，該系統(tǒng)中包裝質(zhì)粒只保留了gag、pol、rev3個(gè)功能基因，刪除了絕大多數(shù)致病基因，安全性顯著提高［17］。

慢病毒載體以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，日益成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。尤其是在動(dòng)物模型中，以慢病毒載體為基礎(chǔ)的基因治療已經(jīng)在許多難治性疾病中取得了明顯效果。目前慢病毒也被廣泛的應(yīng)用于自殺性胸苷激酶基因治療、免疫治療、疫苗開(kāi)發(fā)和以及對(duì)骨髓 抑 制 的 保 護(hù) 研 究［18］。áfrica González－Murillo等［19］研究發(fā)現(xiàn)利用優(yōu)化轉(zhuǎn)錄活性的慢病毒載體可有效治療先天性骨髓發(fā)育不全患者。

4 雞痘病毒載體

近年來(lái)，以禽痘病毒（fowlpox virus，F(xiàn)PV）為表達(dá)載體的研究取得了巨大進(jìn)展，已有NDV、IBDV、IBV、AIV、MDV等病原的保護(hù)性抗原基因在FPV中得以成功表達(dá)。其基因組龐大，長(zhǎng)度約為VV的1．5倍，含較多的復(fù)制非必需區(qū)，可構(gòu)建FPV多價(jià)和多聯(lián)疫苗；FPV具有自身的酶系統(tǒng)和調(diào)控信號(hào)，其轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配均發(fā)生在胞漿中，可對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯加工修飾，并保留其相應(yīng)的生物學(xué)活性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；與VV相比，F(xiàn)PV的宿主范圍較窄，僅感染禽類不易散毒，對(duì)哺乳動(dòng)物和人類尚無(wú)潛在的威脅。

構(gòu)建重組FPV通常分為兩步：第1步是構(gòu)建插入質(zhì)粒，該質(zhì)粒通常含有一段來(lái)自FPV的復(fù)制非必需區(qū)NER，NER包括左側(cè)末端區(qū)，WR株內(nèi)部HindⅢF片段以及胸腺嘧啶激酶TK基因，其中TK基因應(yīng)用最普遍。FPV基因?qū)ν庠椿虻谋磉_(dá)量主要取決于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常選用強(qiáng)啟動(dòng)子，如PE／L，為了方便篩選，還要插入帶有啟動(dòng)子的標(biāo)記基因如LacZ。第2步是將插入質(zhì)粒導(dǎo)入FPV感染的宿主細(xì)胞，質(zhì)粒上的基因與野生FPV基因的同源部分在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組，外源基因在同源重組的同時(shí)插入野生型病毒組中，經(jīng)過(guò)復(fù)制、包裝后形成一個(gè)具有感染能力的rFPV［20］。

重組禽痘苗載體表達(dá)禽類多種病原的保護(hù)性抗原，成為最具潛力的禽源疫苗的載體工具。多項(xiàng)研究通過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子來(lái)避免源抗體的干擾，提高安全性。由MA構(gòu)建的H5N1型禽流感HA和白介素18共表達(dá)的重組FPV可有效增強(qiáng)商品雞體的免疫效力［21］。韓松等［22］構(gòu)建了1株表達(dá)豬殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）RF5／ORF6基因的重組雞痘病毒，并進(jìn)行了小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了免疫評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，所構(gòu)建FPV對(duì)小鼠起到良好的免疫效果，具有成為抗PRRSV感染新型疫苗的潛力。金明蘭等［23］研究重組雞痘病毒對(duì)妊娠母豬及新生仔豬的安全性，結(jié)果表明構(gòu)建的重組雞痘病毒生物安全性好，妊娠母豬及仔豬接種后無(wú)不良反應(yīng)。胡建和等［24］總結(jié)了禽流感病毒新型疫苗的研究進(jìn)展，對(duì)禽流感基因工程亞單位疫苗、活載體疫苗、DNA疫苗等新型疫苗進(jìn)行了綜述。

重組雞痘病毒載體在發(fā)展的同時(shí)，也受到一些因素的限制。如FPV在一定程度上一直了雛雞的增重和免疫應(yīng)答，該病毒可能在不斷的繁殖過(guò)程中出現(xiàn)自身修復(fù)，發(fā)生“毒力恢復(fù)”即毒力返祖。因此，降低載體蛋白表達(dá)量，限制PFV本身組裝形成的子代病毒，進(jìn)一步探索FPV的免疫機(jī)制、接種途徑、接種劑量等，是使FPV得以完善優(yōu)化的關(guān)鍵［25］。

5 人5型腺病毒載體

人類腺病毒（Adenovirus，AD）包括51個(gè)血清型，分為 A、B、C、D、E、F 6個(gè)亞群。C亞群中的Ad5和Ad2型開(kāi)發(fā)最早且研究最多，已被廣泛地應(yīng)用于基因治療、疫苗研究等領(lǐng)域［26］。

作為最常用的基因表達(dá)載體，Had5型基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性研究得比較深入，具有良好的生物安全性，較廣的宿主范圍、不整合、無(wú)插入致突變以及能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。但是這類以CAR為受體的腺病毒存在如下問(wèn)題：靶細(xì)胞定向性不高；毒副作用較大；人體內(nèi)廣泛存在5型腺病毒的中和抗體，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)很快被免疫系統(tǒng)清除；細(xì)胞表面CAR受體在原代腫瘤細(xì)胞、造血系統(tǒng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)量較低。

AD5型在腫瘤基因治療中療效顯著。腫瘤增殖腺病毒治療是近年來(lái)興起的一種新策略。國(guó)外研究最為詳細(xì)的ONYX－015，經(jīng)臨床試驗(yàn)證明，ONYX－015能有效治療頭頸部腫瘤、卵巢腫瘤、肝轉(zhuǎn)移腫瘤以及結(jié)腸直腸的腫瘤等疾病，且與氟尿嘧啶、順鉑等化療藥物具協(xié)同作用。國(guó)內(nèi)重組人5型腺病毒（H101）已被研制并成功應(yīng)用于臨床。H101于2005年被批準(zhǔn)為擁有中國(guó)專利及國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤藥物，是AD5型改造后的有效抗癌藥物，能特異性裂解腫瘤細(xì)胞［27］。重組人5型腺病毒注射液對(duì)9例單側(cè)鼻咽癌的患者的治療也取得了較好的效果。不僅能夠局部消除腫瘤，也能協(xié)助放療及化療患者的治療，尤其是為放療、化療不敏感的患者提供了更佳選擇。使用瘤體局部注射方法患者更易接受，全身毒副作用小且費(fèi)用較低［28］。

6 結(jié) 語(yǔ)

病毒載體由病毒復(fù)制和包裝元件、病毒基因、插入的外源基因或元件、病毒外殼、外膜4部分組成，可用于基因治療、活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因功能研究等領(lǐng)域［29］。理想的病毒載體應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒；介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)；對(duì)機(jī)體不致病，容量為自身基因組大小的105%～110%等。不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。其安全性、靶向性和有效性是構(gòu)建重組病毒載體過(guò)程中優(yōu)化改造的主要方向。

綜上所述，重組病毒載體在研究和實(shí)驗(yàn)上取得了很大的進(jìn)展，而臨床應(yīng)用尚待加強(qiáng)，進(jìn)一步提高病毒載體系統(tǒng)的安全性，對(duì)各種不同的病毒載體優(yōu)化改造，獲得簡(jiǎn)便、高效的包裝系統(tǒng)、可調(diào)控表達(dá)外源基因或靶向性及無(wú)病毒基因的重組病毒載體是今后努力的目標(biāo)。以病毒載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組活載體疫苗成為疫苗研究領(lǐng)域的主要方向［30］。相信這些新型疫苗的研制成功，將為我國(guó)重大動(dòng)物疫病的防控提供有效的技術(shù)支撐。

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