垂體催乳素腺瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

高 普 王 洪 史彥芳 王明棟 賈潮微 陳 研 劉杏棉

（1 河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071000；2 河北曲陽(yáng)縣人民醫(yī)院，河北 曲陽(yáng) 073100）

垂體腺瘤為來(lái)源于垂體前葉的良性腫瘤。隨著影像及內(nèi)分泌診斷技術(shù)的提高，其發(fā)病率有日漸增多的趨勢(shì)。催乳素腺瘤是其中最常見(jiàn)的一種分泌性垂體腺瘤，約占垂體瘤的30%～40%。其中女性患者發(fā)病率比男性患者多5倍。2/3女性患者是微腺瘤，多在20～40歲，以高PRL血癥的溢乳-閉經(jīng)-不育三聯(lián)征就診。男性患者90%以上是大腺瘤，多在40～55歲間，因腫瘤壓迫鞍區(qū)組織就診，多表現(xiàn)為性欲減退，陽(yáng)痿、體重增加、毛發(fā)稀少等。目前垂體催乳素瘤的發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此我們對(duì)PRL瘤進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，從而為研究PRL瘤的病因、發(fā)病機(jī)制，為診斷和治療PRL瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2009年10月至2011年10月住院經(jīng)手術(shù)切除治療的PRL瘤病例16例，其中男性6例，女性10例，年齡30～65歲（平均38.5歲），術(shù)前血清PRL水平檢測(cè)及術(shù)后免疫組化染色均證實(shí)垂體PRL腺瘤。PRL瘤離體后即刻無(wú)菌取材，裝入含Hanks培養(yǎng)液的無(wú)菌試管中。取腫瘤時(shí)盡量取生長(zhǎng)活躍的部位，盡量去除正常組織。

1.2 主要試劑

Hanks液和含雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Beijing solarbio Science&Technology Co.Ltd。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 培養(yǎng)過(guò)程

①取所須己消毒的培養(yǎng)用品置于凈化工作臺(tái)面，紫外線消毒20min。開(kāi)始工作前先洗手，75%酒精擦試手；②在無(wú)菌條件下，選取手術(shù)切除的垂體PRL腺瘤組織，置于小平皿中，用Hanks反復(fù)沖洗2～3次，去除血液等雜質(zhì)，用已消毒的眼科剪將垂體瘤剪碎；③用吸管將其轉(zhuǎn)入含胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中，在室溫下加入0.25%胰酶消化酶消化約15min。5min搖動(dòng)一次，以利于充分消化，腫瘤細(xì)胞分離；④在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液混濁時(shí)，可吸出少許消化液在倒置顯微鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即加入PRMI-1640終止消化；⑤每例標(biāo)本按所取的的多少將細(xì)胞等分至1～3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中；⑥采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法，定時(shí)觀察垂體腺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，定期換液，換下的培養(yǎng)液置于-20℃冰箱中保存，待進(jìn)行激素水平測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

PRL實(shí)測(cè)值變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間比較。用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)的PRL瘤細(xì)胞的特征 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的PRL腺瘤細(xì)胞呈橢圓形或梭形，24h后有部分PRL瘤開(kāi)始半貼壁生長(zhǎng)，大部分呈懸浮生長(zhǎng)。于培養(yǎng)的約第10天開(kāi)始，成纖維細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增多，并逐漸取代PRL瘤細(xì)胞。

2.2 PRL瘤細(xì)胞功能測(cè)定：換下的培養(yǎng)液采用放射免疫方法檢測(cè)。各例PRL腺瘤培養(yǎng)細(xì)胞PRL分泌量第1～5天逐漸增加，第6～8天達(dá)到高峰。測(cè)定結(jié)果顯示培養(yǎng)的PRL瘤細(xì)胞在第7天功能狀態(tài)最佳。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞泌乳素（PRL）的表達(dá)，培養(yǎng)的PRL瘤細(xì)胞呈PRL陽(yáng)性表達(dá)。

3 討 論

垂體腺瘤是一種生長(zhǎng)緩慢的顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率約1/10萬(wàn)人，占須內(nèi)腫瘤的10%。近十年來(lái)，垂體腫瘤的臨床和基礎(chǔ)研究隨著科技的發(fā)展更加深入和迅速。放射免疫，免疫組化和各種內(nèi)分泌激素及其的興奮/抑制實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，以及CT、MRI等影像學(xué)檢查的進(jìn)步，使垂體腫瘤的診斷準(zhǔn)確性較過(guò)去以視野、視力的改變、明顯內(nèi)分泌癥狀和X線片上蝶鞍骨質(zhì)的變化等診斷標(biāo)準(zhǔn)前進(jìn)了一個(gè)時(shí)代。又由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使人們對(duì)垂體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及病理生理的認(rèn)識(shí)不斷深化，從而為臨床診斷、治療開(kāi)辟了廣闊的前景。

PRL腺瘤是垂體腺瘤中的一種最常見(jiàn)的類型，約占垂體瘤的30%～40%，它的治療目前有三種方法：包括藥物控制、手術(shù)切除和放射治療。具體到每個(gè)患者，則要依據(jù)具體情況綜合考慮何種治療方法[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2,3]，垂體腺瘤的惡性程度大多數(shù)不高，且其培養(yǎng)的細(xì)胞不容易貼壁，只有極少數(shù)能夠形成細(xì)胞系并傳代培養(yǎng)，因此其培養(yǎng)較其他腫瘤困難。PRL腺瘤細(xì)胞的貼壁較生長(zhǎng)激素（GH）腺瘤貼壁更困難，多呈懸浮生長(zhǎng)[4,5]。PRL腺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)伴隨著成纖維細(xì)胞的成長(zhǎng)，尤其培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞常與PRL腺瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，時(shí)間越長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)越旺盛。因此排除成纖維細(xì)胞，得到純化的PRL腺瘤細(xì)胞成為其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與PRL腺瘤不同，多呈貼壁生長(zhǎng)，因此我們采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方式，這樣就排除了成纖維細(xì)胞的干擾，而且有利于其生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)其分泌的激素進(jìn)行測(cè)定。

正常垂體激素的分泌是在下丘腦分泌的組釋放激素和抑制激素雙重調(diào)控下進(jìn)行的，而且促釋放激素占優(yōu)勢(shì)，因此脫離了下丘腦的控制、體外培養(yǎng)的正常垂體細(xì)胞激素分泌量隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速下降。我們通過(guò)對(duì)PRL腺瘤細(xì)胞培養(yǎng)，并測(cè)定其激素分泌的特征發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的PRL瘤細(xì)胞在第7天功能狀態(tài)最佳。通過(guò)本次試驗(yàn)研究，可以為以后治療PRL腺瘤提供良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)，可以通過(guò)干預(yù)垂體腺瘤細(xì)胞，觀察PRL腺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及激素分泌特征，為研究PRL腺瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物治療及預(yù)后具有重要意義。

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