中國(guó)炭疽芽胞桿菌中11個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)的特征和分布＊

魏建春，張恩民，張慧娟，張建華

炭疽芽胞桿菌是引起人和動(dòng)物炭疽的病原菌，是一種相對(duì)保守的細(xì)菌，很多基因分型方法都不能對(duì)其分型，已經(jīng)知道多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析方法（MLVA）［1］和單核苷酸多態(tài)性分析（SNP）［2］是兩種比較有效的區(qū)別不同炭疽芽胞桿菌的方法。我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的炭疽芽胞桿菌菌株進(jìn)行了MLVA的分析，發(fā)現(xiàn)有一些串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）位點(diǎn)在我國(guó)的菌株中很保守，在被試菌株中沒(méi)有區(qū)別或只有個(gè)別菌株出現(xiàn)變化，特對(duì)這些相對(duì)保守位點(diǎn)，進(jìn)行進(jìn)一步分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)室保存的109株炭疽芽胞桿菌，來(lái)自全國(guó)17個(gè)省份。

1．2 引物設(shè)計(jì)11個(gè)VNTR位點(diǎn) MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44、vrrA、vrrB1、vrrB2、MS53擴(kuò) 增 用 引 物 序 列 參 照 文 獻(xiàn) 報(bào) 道［1，3－4］，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1．3 材料 2×easy Taq Super Mix、DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，測(cè)序和毛細(xì)管電泳由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1．4 PCR擴(kuò)增和檢測(cè) 反應(yīng)體系：12．5μL 2×mix，1μL模板，上下游引物各0．2μmol／L，加水至25μL。VNTR位點(diǎn) MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44使用以下擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。上樣5μL，2%瓊脂糖凝膠5V／cm電泳2～3h。VNTR位點(diǎn)vrrA、vrrB1、vrrB2和MS53使用以下擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1．5 測(cè)序驗(yàn)證 選擇部分?jǐn)U增產(chǎn)物送測(cè)序。

1．6 序列比對(duì)BLAST和Megaline軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2．1 保守位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增結(jié)果以及差異菌株在我國(guó)的分布 本實(shí)驗(yàn)中11個(gè)位點(diǎn)比較保守，有4個(gè)位點(diǎn) MS53，vrrB1，MS21，MS44，所試菌株擴(kuò)增結(jié)果全部相同，擴(kuò)增產(chǎn)物與已測(cè)序菌株Ames完全一致。另外7個(gè)位點(diǎn)中的5個(gè)，大多數(shù)的被試菌株表現(xiàn)出與Ames一致的特征，只有2個(gè)位點(diǎn)vrrB2和MS15，大多數(shù)被試菌株表現(xiàn)的特征與Ames不同，2個(gè)位點(diǎn)各檢測(cè)出1株與Ames相同的菌株。綜合11個(gè)VNTR位點(diǎn)，我國(guó)的菌株沒(méi)有檢測(cè)到與Ames完全相同的菌株。

在所試的109株菌中，僅10株菌與大多數(shù)菌株有差別，為分離自新疆的2株菌與分離自內(nèi)蒙古的1株菌在2個(gè)位點(diǎn)上與大多數(shù)菌株不同，其他7株菌僅有1個(gè)位點(diǎn)與多數(shù)菌株不同。有差別的菌株多出現(xiàn)在新疆，新疆的4株菌6次檢測(cè)出與其他菌株不同，提示新疆的菌株類型比較復(fù)雜，見(jiàn)表1。

表1 11個(gè)VNTR位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增結(jié)果及差異菌株在我國(guó)的分布Tab．1 PCR results of 11VNTR loci and distribution of divergentstrains

2．2 擴(kuò)增PCR產(chǎn)物所在基因特征 BLAST檢索發(fā)現(xiàn)這11個(gè)VNTR位點(diǎn)所在基因可分為3類，一類是MS28，MS44，MS25，MS23在炭疽芽胞桿菌中有基本明確的功能注釋，一類是 MS21，MS15，MS22在炭疽芽胞桿菌中沒(méi)有明確的注釋，但在與其近源的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中有與其同源性很高的基因，有相應(yīng)的注釋可供參考；另一類是VrrA，VrrB1或 VrrB2，MS53在炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌中均為假想蛋白，沒(méi)有明確的功能注釋。詳細(xì)情況見(jiàn)表2。

表2 11個(gè)VNTR位點(diǎn)所在基因編碼產(chǎn)物Tab．2 The encoded proteins of these genes including 11VNTR loci

3 討 論

MLVA是目前對(duì)炭疽芽胞桿菌菌株鑒別和分型比較有效的方法之一。經(jīng)常使用的有二十多個(gè)位點(diǎn)。本研究主要針對(duì)我國(guó)菌株中比較保守的位點(diǎn)進(jìn)行分析。

新疆的菌株類型復(fù)雜前有報(bào)道［5］，本文發(fā)現(xiàn)的有差別的菌株多出現(xiàn)在新疆，雖然與本次試驗(yàn)所用新疆菌株數(shù)量多有一定關(guān)系，但一樣顯示新疆的炭疽菌株確實(shí)復(fù)雜多樣。這可能與新疆地域廣大，病例較多，細(xì)菌有更多的機(jī)會(huì)發(fā)生變化有關(guān)。

BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所選的11個(gè)位點(diǎn)都在基因編碼區(qū)內(nèi)，都以3的倍數(shù)重復(fù)，不會(huì)改變蛋白編碼序列，只是增加或減少相應(yīng)的氨基酸個(gè)數(shù)。

4個(gè)位點(diǎn)所在基因的編碼產(chǎn)物在炭疽芽胞桿菌中有明確的注釋，包括青霉素結(jié)合蛋白（PBP）、細(xì)胞壁內(nèi)肽酶NlpC／P60家族、芽胞殼組裝蛋白SafA、Internalins。PBP參與細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分——肽聚糖合成的最后階段，在細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖中發(fā)揮重要作用［6］。芽胞殼組裝蛋白SafA在芽胞殼的組裝過(guò)程中具有重要作用［7］。細(xì)胞壁內(nèi)肽酶NlpC／P60家族，在細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖過(guò)程中，通過(guò)水解肽聚糖的各種連接而使細(xì)胞壁重組［8］。Internalins是最初在單核細(xì)胞增多性李斯特菌中發(fā)現(xiàn)的表面蛋白，在細(xì)菌通過(guò)鈣粘素跨膜蛋白侵襲宿主細(xì)胞時(shí)使用，這些蛋白的確切作用以及侵襲力尚不完全清楚［9］。該蛋白與一個(gè)與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白一致性較高487／572（85%），提示可能對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖具有重要作用。

3個(gè)位點(diǎn)所在的基因序列與其近源的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌相似，提示可能具有與蠟樣和蘇云金中相似的功能。其中值得一提的是MS15，MS15所在基因在炭疽芽胞桿菌中編碼BclD蛋白（Bacilluscollagen like protein），與芽胞外壁蛋白BclA相似。BclA蛋白是芽胞外壁發(fā)狀菌絲的主要結(jié)構(gòu)成分，是主要的芽胞表面蛋白，影響芽胞的疏水性和粘附性。后來(lái)發(fā)現(xiàn)的BclB也鑒定是炭疽芽胞桿菌芽胞外壁的成分，之后又發(fā)現(xiàn)BclC、BclD、BclE、BclF和BclG等相似結(jié)構(gòu)蛋白，可能具有與BclA和BclB相似的功能［10］。

還有4個(gè)位點(diǎn)所在基因沒(méi)有注釋明確的功能，似乎只是人們?cè)谔烤已堪麠U菌中發(fā)現(xiàn)的具有高度可變性的群特異性的蛋白。已有文獻(xiàn)［11］提到VrrA是AVA疫苗在人體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的一個(gè)靶蛋白，提示它可能是炭疽芽胞桿菌的潛在毒力因子。這些沒(méi)有明確注釋的蛋白可能也具有一定的功能，因此在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中不易發(fā)生突變，即使突變也不改變蛋白的主要結(jié)構(gòu)和功能。

本實(shí)驗(yàn)中所選擇的VNTR位點(diǎn)都在基因編碼區(qū)內(nèi)，所在基因的編碼產(chǎn)物可能在細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中具有比較重要的作用，因此不易發(fā)生突變。本文結(jié)果提示這些VNTR的變異度較小，可能不適用于我國(guó)炭疽芽胞桿菌的分子分型，但對(duì)于我們了解炭疽芽胞桿菌基因組特征以及炭疽芽胞桿菌的鑒定仍有一定的價(jià)值。

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