鸚鵡熱嗜衣原體基因組學的研究進展＊

黎知青（綜述），吳移謀（審校）

鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cp）是一種嚴格真核細胞內(nèi)寄生的多宿主人獸共患病原體，可感染包括人在內(nèi)的靈長類動物、家養(yǎng)和野生哺乳動物、禽類及兩棲動物，在鳥類中最常見。人類在與感染Cps的鳥類親密接觸后，可引起嚴重的肺炎或發(fā)熱癥狀，亦可引起人—人傳播。2004年公布的伯杰氏細菌分類學手冊將衣原體科分為衣原體和嗜衣原體兩個屬，傳統(tǒng)的鸚鵡熱衣原體稱為鸚鵡熱嗜衣原體，與肺炎嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類嗜衣原體共同組成嗜衣原體屬［1］。與以前的衣原體基因組測序比較表明，同在其它嗜衣原體種內(nèi)一樣，Cps大部分基因組的多樣性僅存在于其變異區(qū)。目前已完成7株Cps基因組測序（表1）。本文就Cps基因組結構、功能等作一綜述。

1 Cps基因組概述

1．1 Cps 6BC株 2011年5月德國Anja Voigt教授［2］及其科研組完成了對Cps 6BC株的基因組測序工作。Cps 6BC株最初是于1941年從澳大利亞的一只鸚鵡中分離出來的。鳥類株6BC是Cps的代表株［3］。它的基因組全長1 171 660bp，G＋C%為39．06%，預測其89．39%的基因組為編碼序列，其中有1 016個蛋白編碼基因，38個tRNA基因和1個rRNA操縱子，此操縱子含有3個rRNAs（5S、23S和16S）。此外還含有一個7 553bp的質粒，含8個蛋白編碼基因。Cps 6BC，流產(chǎn)嗜衣原體S26／3（NC＿004552）、豬嗜衣原體Fe／C～56（NC＿007899）和豚鼠嗜衣原體GPIC（NC＿003361）具有很高的同源性。

1．2 Cps RD1株 2010年11月英國Helena教授及其科研組完成了對Cps RD1株的基因組測序工作，這是第一個全基因組測序的Cps株。Cps RD1株的基因組全長為1 164 076bp，推測有959個蛋白編碼基因，36個tRNA基因和1個rRNA操縱子，并且在屬間基因成分和順序表現(xiàn)出高度的保守性。通過Artemis和ACT軟件，與最相關的衣原體種流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體和豬嗜衣原體比較分析表明，Cps RD1株與它們的平均核苷酸同源性分別是91．3%、85．9%和84．8%［4］。此基因組含有6個重疊群。在Cps RD1株基因組中，共有5個未延伸的缺口，與流產(chǎn)嗜衣原體相比較，其大小分別是：在pmp11G和pmp13G（沒有pmp12G）之間是3 592bp，在pmp16G的3′末端是116bp，其它3個在rRNA操縱子，分別是887bp﹑797bp和1 481bp。

表1 已完成全基因組測序的Cps菌株Tab．1 Complete whole－genome sequencing of Cps strains

Cps strain RD1的質粒被命名為pRD1，長度是7 553bp，編碼8個CDSs，與Cps質粒pCpA1只有4個單個核苷酸多態(tài)性的不同。

1．3 Cps Cal10株 Cps Cal10株曾命名為腦膜肺炎病毒，最初從被灌輸了患有呼吸道感染的人的喉沖洗液的雪豹中分離出來的，是實驗室廣泛使用的菌株。2011年4月美國馬里蘭大學Valerie教授及其科研組完成了對Cps Cal10株的基因組測序工作［5］。Cps Cal10株的基因組全長為1 169 283bp，推測有982個蛋白編碼基因。與Cps 6BC株一樣，其含有保守的Cps質粒（8CDSs，7 553bp）。在變異區(qū)（PZ）、Cps Cal10和6BC都含有一個單個的長的細胞毒素同源。還含有兩個毒力相關膜攻擊復合體基因（virulence－associated membrane attack complex／perforin gene），一長一短，而這種基因在除肺炎嗜衣原體LPCoLN株外，其它衣原體基因組中是較短或缺失［6］。

Cps Cal10和6BC的基因組基本上是相同的，都含有119個基因內(nèi)單核苷酸多形態(tài)性（SNPs）（48個非同義的、30個同義的和41個插入或缺失），其中鑒定出來的有31個。SNP集中在四個區(qū)域：一個在細胞毒素同源的PZ，兩個在遠處的pmpG簇，第四個在編碼磷酸肌醇－4－磷酸5－激酶和脂質修飾酶的CDS上，此酶涉及到肌動蛋白的重塑，這與衣原體進入宿主細胞有關。

1．4 Cps C19／98，01DC11，02DC15和08DC60株綿羊的Cps C19／98株于1998年從胎盤中分離出來，豬的Cps 01DC11株于2001年從豬的結膜拭子中分離出來，牛的Cps 02DC15株于2002年從流產(chǎn)的牛胎中分離出來［7］，人的Cps 08DC60株于2008年從支氣管的灌洗液中分離出來。2011年7月德國萊布尼茨天然產(chǎn)品研究和感染生物學研究所Gerhard等完成了這四株的基因組測序工作［8］，如表1。豬的Cps 01DC11株比其它株的基因組小些的原因是它缺乏一個衣原體多形態(tài)膜蛋白。這四株間總共有158個單核苷酸多態(tài)性和72個缺失。進一步研究這些多態(tài)性，有助于鑒定出與致病機制和宿主特異性有關的遺傳因子。

2 Cps基因組的組成

Cps基因組中存在主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）基因、多形態(tài)膜蛋白（PMP）基因、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）和包涵體膜蛋白（Inc）基因。對Cps的基因功能研究結果表明，Cps存在與其它種屬相似功能的DNA復制、修復、轉錄、翻譯等基因，Cps也存在獨特功能的基因，這些基因與Cps多形態(tài)外膜結構、特異性蛋白、Ⅲ型分泌系統(tǒng)等有關。

2．1 主要外膜蛋白基因 人類已經(jīng)證明衣原體的MOMP是最重要的保護性抗原。MOMP上有血清型特異性中和抗體表位，它們在保護性免疫中具有很關鍵的作用。momp基因在衣原體基因組上是單拷貝，它是衣原體基因分型的重要依據(jù)之一。Cps momp基因大部分是保守的，除了有4個可變域（VDs，VD I～IV）對稱散開分布，所有的插入和缺失也都發(fā)生在這些VDs，它們的位置與沙眼衣原體中的一樣。而在其它已知MOMPs的同一位置是7個半胱氨酸。這強調(diào)了MOMP結構和功能的重要性。Cps血清型A和D的momp基因的核苷酸序列與Cps6BC血清型A的相似性分別是98．9%和87．8%，與CpsNJ1株血清型D的分別是84．6%和99．8%，與豚鼠包涵體性結膜炎株的分別是79．1%和81．1%，與沙眼衣原體L2株的分別是60．9%和62．5%，與肺炎嗜衣原體IOL－207株的分別是57．5%和60．4%。Cps與沙眼衣原體的momp基因來自于同一祖先。2008年 Zhang等人［9］將momp基因與不耐熱毒素B基因（LTB）融合，并轉入到水稻中，成功地檢測到LTB～MOMP融合蛋白占總可溶性葉蛋白的0．0033%～0．0054%，并且此蛋白保持了固有的抗原性和形成五聚體的能力。這吸引著我們進一步研究利用momp基因產(chǎn)生保護性血清和粘膜抗體的能力。

Konrad等［10］人對momp基因進行BLAST分析，形成一個分支圖，此圖顯示Cps間momp的多樣性，這增加了種間的變異性。雖然肺炎嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、獸類衣原體、豬嗜衣原體和豚鼠嗜衣原體都排列在一條單獨的分支上，但Cps的幾個基因分型卻形成各自單獨的分支。因此可以通過對momp基因測序進行基因分型和診斷。

2．2 多形態(tài)膜蛋白（PMP）基因 PMP蛋白基因是衣原體科所獨有的基因，至今在所測序的基因組中非常突出。PMP與衣原體的感染和免疫機制相關［11］。Cps不同菌株基因組中存在著pmp基因，如在CpsS26／3基因組中已鑒定出6個pmp基因；在Cps 6BC基因組中也發(fā)現(xiàn)21個pmp基因，其中有7個與流產(chǎn)嗜衣原體的pmp90A／B和pmp91A／B基因非常接近。至少有6個基因編碼PMP 90和PMP 98蛋白家族［12］。pmp基因是多拷貝基因，其在Cps基因組上的拷貝數(shù)在4～10個以上，相對定量研究表明不同Cps流行株的pmp基因在基因組上的拷貝數(shù)可能存在較大差異。宋立華等人［13］發(fā)現(xiàn)momp基因和pmp基因的引物均可用于Cps檢測，在標本中靶標濃度高時，pmp引物的檢測靈敏度優(yōu)于momp引物，但前者的擴增效率低于后者，后者更適合用于Cps的實時定量PCR檢測。2007年，Karine等人［11］發(fā)現(xiàn)以保守的pmp基因為靶點的PCR用于檢測禽衣原體病非常有效，并且比momp基因更敏感。由上可知，pmp基因是改進Cps診斷方法的候選基因。6BC株基因組測序的完成有利于其引物的設計，并能更好地解釋所觀察到的PCR條帶。

2．3 Ⅲ型蛋白分泌物基因 2007年，Delphine等人［14］第一次證明了Cps T3SS的存在。它們對14個全長的 T3SS基因（scc1、sctW、sctJ、sctL、sctR、sctS、scc2、copD1、sctN、sctQ、sctC、incA、ca037、和cadd）進行了測序，檢測了26個Cps T3SS基因的RNA轉錄水平，它們分別為簇1（scc1、sctW、sctV和sctU）、簇 2（sctJ、sctL、sctR、sctS、sctT、scc2、copB1和copD1），簇 3（sctD、sctN、ca037、sctQ、pkn5和sctC）和非簇基因（incA、incC、scc3、copD2、cap1、tarp、ca530和cadd），并研究了3個基本結構蛋白（SctW、SctC和SctN）和一個假定效應蛋白（IncA）的翻譯和定位。這些蛋白在發(fā)育周期的早期（1．5～8hp．i．）或晚期（＞24hp．i．）進行表達，編碼T3SS結構蛋白的基因從中期（12～18hp．i．）轉錄。T3SS能介導抗宿主效應蛋白進入衣原體包涵體膜或者真核細胞的胞質中。Nicole等人［15］發(fā)現(xiàn)T3SS效應蛋白IncA能和宿主G3BP1蛋白相互作用，從而減少c～Myc蛋白的濃度，這很可能是Cps逃避凋亡和減少宿主細胞增殖的一種機制。

2．4 包涵體膜蛋白（Inclusion body envelope protein，Inc）基因 IncA是第一個鑒定出來的在衣原體發(fā)育形式外具有重要功能的基因產(chǎn)物。IncA蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基能被宿主細胞磷酸化，并在Cps感染的細胞中，IncA定位于衣原體包涵體膜表面。雖然IncA、IncB和IncC間沒有明顯的相似性，但它們都含有一個相同大小和特點的疏水區(qū)。incB和incC上游區(qū)的序列分析顯示這兩個ORFs與氨基酸轉運體和鈉依賴轉運體有很高的同源性。沙眼衣原體血清型D的基因組分析表明它有編碼incB和incC同源物的ORFs。Inc對Cps的感染，以及其在宿主細胞內(nèi)的生長和存活都有很重要的作用，且可能與不同衣原體種的不同包涵體形態(tài)有關。對Inc的進一步研究，有利于了解衣原體的細胞環(huán)境和鑒定出能作為疫苗的蛋白質。

3 展 望

隨著人類基因組測序的理論和技術飛速發(fā)展，以及Cps基因組全序列的測定及功能的研究，人們對它的生長發(fā)育和代謝以及相關的致病因子與作用機制，都有了初步的了解。但至今為止，人們對Cps的生物學和遺傳學了解甚少，Cps的原體和網(wǎng)狀體是怎樣調(diào)控的？有何特殊的調(diào)控機制？T3SS在感染過程中究竟是怎樣發(fā)揮作用的？如何對Cps進行快速有效地檢測？這些問題都尚不清楚，有待進一步研究。

［1］Pannekoek Y，Morelli G，Kusecek B，et al．Multi locus sequence typing of Chlamydiales：clonal groupings within the obligate intracellular bacteria Chlamydia trachomatis［J］．BMC Microbiol，2008，8：42．DOI：10．1186／1471－2180－8－42

［2］Voigt A，Schofl G，Heidrich A，et al．Full－length de novo sequence of the Chlamydophila psittaci type strain，6BC［J］．J Bacteriol，2011，193（10）：2662－2663．DOI：10．1128／JB．05382－11

［3］Everett KD，Bush RM，Andersen AA．Emended description of the order Chlamydiales，proposal of Parachlamydiaceae fam．nov．a(chǎn)nd Simkaniaceae fam．nov．，each containing one monotypic genus，revised taxonomy of the family Chlamydiaceae，including a new genus and five new species，and standards for the identification of organisms［J］．Int J Syst Bacteriol，1999，49Pt 2：415－440．DOI：10．1099／00207713－49－2－415

［4］Seth－Smith HM，Harris SR，Rance R，et al．Genome sequence of the zoonotic pathogen Chlamydophila psittaci［J］．J Bacteriol，2011，193（5）：1282－1283．DOI：10．1128／JB．01435－10

［5］Grinblat－Huse V，Drabek EF，Creasy HH，et al．Genome sequences of the zoonotic pathogens Chlamydia psittaci 6BC and Cal10［J］．J Bacteriol，2011，193（15）：4039－4040．DOI：10．1128／JB．05277－11

［6］Myers GS，Mathews SA，Eppinger M，et al．Evidence that human Chlamydia pneumoniae was zoonotically acquired［J］．J Bacteriol，2009，191 （23）：7225－7233． DOI：10．1128／JB．00746－09

［7］Goellner S，Schubert E，Liebler－Tenorio E，et al．Transcriptional response patterns of Chlamydophila psittaci in different in vitro models of persistent infection［J］．Infect Immun，2006，74（8）：4801－4808．DOI：10．1128／IAI．01487－05

［8］Schofl G，Voigt A，Litsche K，et al．Complete genome sequences of four mammalian isolates of Chlamydophila psittaci［J］．J Bacteriol，2011，193（16）：4258．DOI：10．1128／JB．05382－11

［9］Zhang X，Yuan Z，Guo X，et al．Expression of Chlamydophila psittaci MOMP heat－labile toxin B subunit fusion gene in transgenic rice［J］．Biologicals，2008，36（5）：296－302．DOI：10．1016／j．biologicals．2008．04．002

［10］Sachse K，Laroucau K，Hotzel H，et al．Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes［J］．BMC Microbiol，2008，8：63．DOI：10．1186／1471－2180－8－63

［11］Laroucau K，Trichereau A，Vorimore F，et al．A pmp genesbased PCR as a valuable tool for the diagnosis of avian chlamydiosis［J］．Vet Microbiol，2007，121（1－2）：150－157．

［12］Liu GQ，Zhu H．Research progress on of Chlamydia polymorphic membrane proteins［J］．Progress Microbiol Immunol，2007（1）：69－72．（in Chinese）劉光橋，朱虹．衣原體多形態(tài)膜蛋白研究進展［J］．微生物學免疫學進展，2007（1）：69－72．

［13］Song LH，He J，Li YW，et al．Comparison on two pairs of primer used in fluorescent quantitative assay to detect genes encoding the major outer membrane protein and the polymorphic membrane protein of Chlamydophila psittaci［J］．Chin J Zoonoses，2009（12）：1139－1142．（in Chinese）宋立華，何君，李巖偉，等．鸚鵡熱嗜衣原體兩對熒光定量PCR引物的應用與比較［J］．中國人獸共患病學報，2009（12）：1139－1142．

［14］Beeckman DS，Geens T，Timmermans JP，et al．Identification and characterization of a type III secretion system in Chlamydophila psittaci［J］．Vet Res，2008，39（3）：27．DOI：10．1051／vetres：2008002

［15］Borth N，Litsche K，F(xiàn)ranke C，et al．Functional interaction between type III－secreted protein IncA of Chlamydophila psittaci and human G3BP1［J］．PLoS One，2011，6（1）：e16692．DOI：10．1371／journal．pone．0016692