流感病毒感染p53＋／＋和p53－／－小鼠肺組織中TLR及其相關(guān)基因表達(dá)研究＊

晏文君，史子學(xué)，魏建超，鄧緒芳，朱紫祥，邵東華，王少輝，李蓓蓓，馬志永

甲型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）屬于正黏病毒科，單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，是近年來對人類健康及養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害的呼吸道疾病病原。根據(jù)病毒粒子表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，分別分為16個亞型（H1－H16）和9個亞型（N1－N9），它們之間的變異及重組造成了流感病毒的高變異性，給流感病毒防治帶來了嚴(yán)重的困難［1－2］。

近年來關(guān)于IFN－β抗流感病毒機(jī)制的解釋［3］以及一些新的抗流感病毒分子RIG－Ⅰ、GBP1和p53等的發(fā)現(xiàn)為闡明機(jī)體抗流感病毒免疫反應(yīng)機(jī)制提供了新的思路［4－6］。其中腫瘤抑制因子p53作為機(jī)體基因的守護(hù)者，其抗病毒機(jī)制是近來關(guān)注的重點。研究表明，干擾素調(diào)節(jié)基因5（interferon regulatory factor 5gene，IRF－5）、IRF9是 p53的靶基因［7－8］，IFN－Ⅰ上調(diào) p53的表達(dá)［9］，p53具有抑制炎癥作用［10］。Toll－like receptor（TLR）在先天性免疫以及后續(xù)的獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，最近證實TLR3是p53的靶基因［11］以及p53具有調(diào)控TLR信號通路的作用［12］。據(jù)報道，TLR3在啟動流感病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［13］，p53基因敲出小鼠抗流感病毒的先天性和獲得性免疫應(yīng)答受到影響［6］，我們同樣發(fā)現(xiàn)p53基因敲出小鼠的抗流感能力顯著下降。那么，在流感病毒感染過程中，p53與TLR信號通路間是否存在相互作用，p53功能喪失是否影響TLR信號通路功能是值得研究的科學(xué)問題，其結(jié)果將有助于闡述和解釋p53抗流感病毒的作用機(jī)制 。

為了探討在流感病毒感染過程中，p53對TLR信號通路的調(diào)控作用，本研究通過流感病毒PR8感染p53基因野生型（p53＋／＋）和p53基因敲出（p53－／－）小鼠，通過基因芯片技術(shù)分析了兩種小鼠肺臟組織中TLR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，為闡述和解釋p53抗流感病毒的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 8～10周齡，p53＋／＋和p53－／－C57BL／6小鼠由本實驗室（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生實驗室）飼養(yǎng)、繁殖并對小鼠p53基因型進(jìn)行檢測。

1．1．2 毒株 實驗采用流感病毒PR8株（A／Puerto Rico／8／34（H1N1）），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所童光志研究員惠贈。

1．1．3 主要試劑 乙醇、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1V／V）、SNET BUFFER（20mmol／L Tris－Cl，pH 8．0；5mmol／L EDTA，pH 8．0；400mmol／L NaCl；1%SDS，m／V）、蛋白酶 K（20mg／mL）、dNTP、rTaq酶。

1．2 方法

1．2．1 小鼠基因組DNA提取 參照分子克隆實驗手冊，剪取10～20d齡小鼠鼠尾末端三分之一放入1．5mL Eppendorf管中，加入400μL裂解緩沖液（蛋白酶K濃度為400μg／mL的SNET Buffer），水浴鍋中55℃過夜。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇，室溫劇烈振蕩3～5min。12 000r／min離心10 min。取上清于另一新Eppendorf管中，加入等體積異丙醇沉淀DNA。1 200r／min離心10min，去除異丙醇，加入70%乙醇洗滌，除去70%乙醇，室溫涼干，200μL TE溶解。

1．2．2 小鼠p53基因型檢測 PCR擴(kuò)增p53＋／＋、p53－／－基因，引物為：

根據(jù)TaKaRa rTaq操作說明PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性5min；95℃變性30s，57℃退火30 s，72℃延伸1min，5個循環(huán)；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；最后72℃，延伸10min。取PCR產(chǎn)物10μL，進(jìn)行15g／L瓊脂糖凝膠電泳，最后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1．2．3 病毒滴度——雞胚半數(shù)感染劑量（50%egg infections dose，EID50）測定 參照流感病毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將病毒儲存液用PBS溶液進(jìn)行系列10倍稀釋，從10－1～10－14每枚雞胚接種0．1mL稀釋液，每個稀釋度接種3枚雞胚。35℃溫箱培養(yǎng)，72 h后收獲病毒尿囊液并進(jìn)行紅細(xì)胞凝集（HA）滴定。根據(jù)Reed－Muench方法，計算病毒EID50。

1．2．4 病毒對小鼠半數(shù)致死量（50%lethal dose，LD50）測定 將8～10周齡p53＋／＋小鼠30只，平均分成6組，每組5只。病毒液用PBS進(jìn)行系列10倍稀釋，每只小鼠從鼻內(nèi)接種病毒稀釋液25μL，觀察小鼠死亡情況，并記錄，最后根據(jù)Reed－Muench方法，計算得到病毒對小鼠半數(shù)致死劑量LD50。

1．2．5 基因芯片分析小鼠肺臟基因表達(dá)情況p53＋／＋、p53－／－小鼠各12只，分別分成4組，每組3只，兩組鼻內(nèi)接種1LD50的病毒液，另外兩組接種25μL PBS作為對照。在感染病毒后第3d，第6 d各處死1組小鼠并采取肺臟，凍存于液氮中。由上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Affymetrix Mouse 430 2．0基因芯片，分析小鼠肺臟RNA表達(dá)情況。其中，每組小鼠肺組織提取的總RNA即為一個樣品。

1．2．6 挑選出TLR通路基因數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析登錄由上海伯豪生物技術(shù)有限公司生物服務(wù)在線所 提 供 的 SAS 系 統(tǒng) （http：／／www．ebioservice．com／），并參照有關(guān)基因芯片分析方法進(jìn)行差異基因及基因信號通路分析。

2 結(jié) 果

2．1 小鼠基因型檢測及分析 PCR方法檢測小鼠p53基因，p53＋／＋基因PCR產(chǎn)物大小約為400 bp，p53－／－基因PCR產(chǎn)物大小約為250bp（如圖1）。圖中3只小鼠基因型分別為p53＋／－、p53＋／＋、p53－／－。

圖1 小鼠p53基因結(jié)果示例Fig．1 Example of mice p53gene detection

2．2 EID50及LD50的測定 通過雞紅細(xì)胞凝集實驗對流感病毒PR8EID50測定。經(jīng)計算，得到流感病毒對雞胚半數(shù)感染劑量為：EID50＝10－9．36／100 μL（表1）。通過流感病毒稀釋液鼻內(nèi)接種p53＋／＋小鼠25μL測定病毒對小鼠的半數(shù)致死量。經(jīng)計算，得到PR8對小鼠的半數(shù)致死量為：LD50＝10－3．34／50μL，實驗中接種小鼠劑量1LD50為4．1×105EID50的病毒（表2）。

表1 流感病毒PR8雞胚半數(shù)感染劑量測定結(jié)果Tab．1 Detection results of EID50for PR8

2．3 TLR基因表達(dá)水平檢測 通過real－time PCR對基因表達(dá)譜芯片結(jié)果的進(jìn)行驗證，結(jié)果相符（real－time PCR結(jié)果省略）。篩選出 TLR基因，并對其表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)p53＋／＋與p53－／－小鼠相比，在流感病毒感染后，第3dTLR4表達(dá)下調(diào)，TLR8表達(dá)上調(diào)；第6dTLR1、TLR2、TLR6、TLR7、TLR8表達(dá)上調(diào)，TLR9表達(dá)下調(diào)（圖2）。

表2 PR8對小鼠的半數(shù)致死劑量Tab．2 Detection results of LD50for PR8

圖2 病毒感染3d和6d后，TLR基因表達(dá)結(jié)果Fig．2 Expressions of TLRs genes on day 3and day 6after the infection of PR8

2．4 TLR通路差異表達(dá)基因 對TLR信號通路基因表達(dá)水平分析，發(fā)現(xiàn)在病毒感染3d后，p53＋／＋與p53－／－小鼠相比有17個基因表達(dá)上調(diào)，19個基因表達(dá)下調(diào)；在病毒感染6d后，有16個基因表達(dá)上調(diào)，17個基因表達(dá)下調(diào)（圖3）。2．5 差異表達(dá)基因在TLR信號通路中的分析病毒感染后，第3dTLR信號通路中TLR8、Rac1、AKT、JNK、p38、IFN－α、AP－1、CD40、IRF7等基因表達(dá) 上 調(diào)；TLR4、CASP8、TNF－α、IL－1β、IL－12、CD80、CD86、NF－κB 等表達(dá)下調(diào)；TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR9、MyD88、IRF5、IFN－β、IL－8、IL－6等基因表達(dá)沒有明顯變化。與炎癥反應(yīng)有關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，而與免疫細(xì)胞激活及抗病毒反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)（圖4）。

2．6 病毒感染后第6d TLR1、TLR2、TLR6、TLR7／8、P13K、P38、IFR7、IL－12、IFN－α、IP－10 等基因表達(dá)上調(diào)；TLR9、CD80等基因表達(dá)下調(diào)；TLR3、TLR4、TLR5、JNK、IRF5、MyD88、NF－κB、IL－6、IL－1β、IFN－β等基因表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化。與第3d相比，趨化反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而與免疫細(xì)胞激活相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)（圖5）。

3 討 論

腫瘤抑制因子p53作為基因組的守護(hù)者，通過細(xì)胞周期捕獲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而阻止癌細(xì)胞及機(jī)體腫瘤的發(fā)生，還能參與DNA損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及調(diào)節(jié)繁殖生育等功能。從發(fā)現(xiàn)p53與NF－κB有密切關(guān)系［14］，PKR、ISG15、TLR3、IRF5、IRF9等是其靶基因以來［15－16］，p53抗病毒作用就一直受到關(guān)注。2003年，Takaok A等在Nature上首次報道，p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，開辟了p53抗病毒研究的里程碑［9］。隨后，分別有關(guān)于p53抗新城疫病毒、Ⅲ 型人副流感病毒、人腦心肌炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的報道。

圖5 流感病毒感染后第3d，TLR主要通路中基因表達(dá)變化情況Fig．5 Expression of TLR pathway genes on day 3after the infection of IAV

在流感病毒研究上，p53參與調(diào)控流感病毒感染細(xì)胞的凋亡，流感病毒感染后機(jī)體p53蛋白水平呈現(xiàn)雙向變化，流感病毒NS1具有抑制p53活性的報道［17－18］。2011 年，Munoz－Fontela C 等 報 道 p53參與調(diào)控流感病毒的先天性和獲得性免疫反應(yīng)，具有抗流感病毒作用［6］。但是，關(guān)于p53抗流感病毒的具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。本研究通過流感病毒PR8毒株感染p53＋／＋、p53－／－小鼠，分析第3d和第6d小鼠肺臟組織中TLR家族基因及有關(guān)信號通路基因表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)第3d和第6dTLR8表達(dá)發(fā)生了明顯上調(diào)，這與TLR8主要是抗ssRNA病毒相一致；而第6d時只有TLR2和TLR6發(fā)生了上調(diào)，可能是在病毒感染后期機(jī)體對刺激的反應(yīng)而引起；對于TLR9在病毒感染第6d時發(fā)生了下調(diào)，這可能是與TLR9是一種識別細(xì)菌的模式識別受體，也暗示TLR9可能與炎癥有關(guān)。據(jù)報道，TLR9能夠增加IL－1、IL－6、IL－12等的細(xì)胞因子的分泌而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［19－21］，這也與p53抗炎癥反應(yīng)相符合。在通過對病毒感染后第3 d和第6dTLR信號通路中差異基因的分析表明，NF－κB表達(dá)發(fā)生了下調(diào)而IFN－α表達(dá)上調(diào)，這可能暗示它們在p53抗流感病毒中起著重要作用；相反地，作為p53靶基因的IRF5和TLR3表達(dá)卻沒有發(fā)生變化。p53作為轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄作用是在特定的刺激下產(chǎn)生一定的生物學(xué)作用，這暗示IRF5和TLR3雖然是p53的靶基因，但在流感病毒感染機(jī)體時，p53并不是通過調(diào)控IRF5和TLR3的表達(dá)而起到抗流感病毒作用的。

本研究通過流感病毒感染p53＋／＋和p53－／－小鼠，采用基因芯片分析了TLR家族成員及相關(guān)通路基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了在p53缺失的情況下，TLR8、TLR9、P13K、P38、IFR7、IL－12、IFN－α、NF－κB等免疫相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)異常，顯示了在流感病毒感染過程中，這些TLR信號通路分子的表達(dá)直接或間接地受p53的調(diào)控，同時，也揭示了p53可能通過調(diào)控TLR8的表達(dá)和與TLR信號通路中其它基因，如IFN－Ⅰ、NF－κB、TNF等而起到抗流感病毒作用的。

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