非小細胞肺癌的BRAF基因突變及其臨床意義

黃志敏 吳一龍

BRAF基因激活突變可發(fā)生于多種腫瘤及癌細胞系中，尤其常見于惡性黑色素瘤。近年來研究提示BRAF基因激活突變可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展及治療預后有密切的關系。本文就BRAF基因的結構、表達、信號通路調(diào)節(jié)及研究熱點、與腫瘤發(fā)生的關系尤其是與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的靶向治療關系加以闡述。

1 BRAF基因及家族

BRAF基因，1988年由Ikawa等[1]首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認，是一個能轉染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列，因其與CRAF和ARAF具有相當高的同源性，故稱其為BRAF。位于染色體7q34的BRAF基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，該家族還包括ARAF、CRAF，三者的編碼產(chǎn)物均存在于細胞間質(zhì)中，其中ARAF蛋白主要位于泌尿生殖器官，BRAF主要位于神經(jīng)及睪丸組織，CRAF在人體內(nèi)廣泛分布。BRAF蛋白由783個氨基酸組成，從N端到C端依次為CR1、CR2和CR3三個保守區(qū)。其中CR1區(qū)由RAS蛋白結合區(qū)和富含半胱氨酸區(qū)組成，這兩個區(qū)域均可與RAS結合；CR2富含絲氨酸/蘇氨酸，為調(diào)節(jié)磷酸化RAF激酶活性；CR3區(qū)為ATP結合位點和激活區(qū)，含有酪氨酸和絲氨酸殘基及有多個磷酸化位點，其中T598和S601最為重要，這兩個位點同時磷酸化后可激活BRAF蛋白和誘導性激活ERK[2]，而這兩個位點氨基酸的置換將導致BRAF蛋白持續(xù)性活化。

2 BRAF與RAS-RAF-MEK-ERK信號通路

BRAF蛋白與KRAS蛋白同為RAS-RAF-MEK-ERK信號通路中上游調(diào)節(jié)因子[3]，在MAPK/ERK信號通路中起著舉足輕重的作用。RAS蛋白屬于小GTP結合蛋白，與三磷酸鳥苷GTP及二磷酸鳥苷GDP有很強的親和性，RASGTP為RAS的活化形式，RAS-GDP為非活化形式，二者能夠相互轉化，對細胞分化、增殖起調(diào)節(jié)作用[4]。酪氨酸激酶受體與生長因子結合，能使酪氨酸蛋白激酶受體二聚化及殘基磷酸化，促使銜接分子Grb2與SOS結合，細胞外信息經(jīng)此途徑被轉導至細胞內(nèi)。SOS通過使RASGDP轉化RAS-GTP從而活化RAS激酶活性。RAS-GTP復合物可調(diào)節(jié)一系列細胞進程，如增殖、生長和分化[5]。RAS可以通過激活至少10條下游反應通路途徑而發(fā)揮作用。其中研究比較透徹的是RAF-MEK-ERK通路（經(jīng)典MAPK通路）。RAS-GTP與其下游效應分子RAF結合，使RAF磷酸化并激活，從而激活了RAF下游信號轉導MAPK級聯(lián)途徑。RAF蛋白磷酸化并激活下游底物MEK，而MEK磷酸化并激活下游底物ERK，進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的生物學過程[6]。其中MEK具有磷酸化蘇氨酸/酪氨酸殘基的雙特異功能，ERK為富含脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。

3 BRAF的分子變異

目前有超過40種BRAF突變被識別[7]，其中最主要有兩種類型，80%突變發(fā)生于激酶功能域的V600E（即外顯子15），20%突變位于外顯子11的甘氨酸環(huán)。以上兩種突變均可使BRAF激酶活性提高。研究證實V600E突變后能夠產(chǎn)生類似于T598和S601兩個位點磷酸化的作用，使BRAF蛋白持續(xù)激活，激活后的BRAF通過下游MEK/ERK傳導通路刺激細胞的增殖和分化。其它一些發(fā)生率較低的BRAF基因突變多集中于外顯子11甘氨酸環(huán)的突變?nèi)鏡461I、 I462S、 G463E、 G463V、G465A、 G465E、G465V、 G468A、 G468E、 N580S、E585K、 D593V、F594L、 G595R、 L596V、T598I、V600D、V600E、V600K、V600R、K601E、A727V等，也可通過直接激活BRAF而激活MEK/ERK傳導通路[2]。

4 BRAF突變與腫瘤

腫瘤的發(fā)生與介導細胞增殖、分化及凋亡的一些關鍵基因的突變有密切關系，RAS信號轉導通路的激活與許多腫瘤的發(fā)生有關。BRAF基因突變可通過兩種途徑致病，一是因遺傳而導致先天性缺陷的途徑，二是后天獲得致癌基因而導致腫瘤的途徑。BRAF蛋白與KRAS蛋白同為RAS-RAF-MEK-ERK信號通路中上游調(diào)節(jié)因子[3]。BRAF在MAP/ERKs信號通路中起著舉足輕重的作用，BRAF蛋白位于MEK/ERK途徑的入口處，它將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內(nèi)的轉錄因子相連接，影響細胞分化、分裂、增殖、生長[3]。BRAF的持續(xù)激活可引起MEK/ERK信號轉導紊亂，導致細胞過度增殖、惡變。BRAF基因突變最先在黑色素瘤患者中檢測到，在黑色素瘤、甲狀腺瘤中突變率較多（約80%），而在淋巴瘤、直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中突變率較少[7]。BRAF突變以T1799A點突變即V600E最為常見，T1799A點突變是外顯子15上第1,799位核苷酸T→A的轉換，導致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）替代[8]，常見于甲狀腺瘤、直腸癌及黑色素瘤患者。

5 BRAF基因突變與NSCLC

5.1 BRAF突變在NSCLC中的流行病學特點 NSCLC BRAF突變率約為3%[8]，其中大部分是腺癌。一項肺癌小鼠模型[3]表明，NSCLC中存在BRAF的V600E突變表達上調(diào)。近來一項研究[9]對697例肺腺癌患者進行EGFR、KRAS與BRAF突變檢測及相關分析，記錄包括患者年齡、性別、種族、腫瘤分期、治療史及吸煙史等臨床特征。其中使用基于質(zhì)譜分析法的MassARRAY系統(tǒng)（Sequenom, San Diego, CA）對BRAF突變進行分析，識別了3種BRAF突變：V600E（外顯子15）、G469A（外顯子11）、D594G（外顯子15）。與黑色素瘤的BRAF突變80%以上為V600E突變不同，NSCLC的BRAF突變主要為激酶結構域中D594G突變（11%, n=2）及在活化域中甘氨酸環(huán)G469A突變（39%, n=7）和V600E突變（50%, n=9）[8]。近年來研究[10]表明，BRAF蛋白可以獨立于RAS蛋白而發(fā)生作用。BRAF基因突變與EGFR、KRAS等突變相互獨立、相互排斥且不同時出現(xiàn)[9,11]，在這18例BRAF突變的患者中未檢測到EGFR、KRAS或ALK突變[9]，也佐證了這個說法。BRAF與KRAS基因突變可能發(fā)生于腫瘤發(fā)生的相似階段，即始動后惡性轉變前，這兩種突變可能在腫瘤的發(fā)生作用中是等同的。在生物學上，BRAF突變會使得激酶活性增加，且能使MAPK2、MAPK3結構性活化。近年一項研究[9]提示，與EGFR、KRAS突變多發(fā)生于非吸煙肺癌患者不同，BRAF突變多發(fā)生于吸煙肺癌患者。

5.2 BRAF抑制劑 目前已經(jīng)研發(fā)出許多BRAF抑制劑。第一代BRAF抑制劑索拉菲尼是首個已有臨床試驗的RAF激酶抑制劑，目前被FDA批準在腎細胞癌和肝細胞癌中使用[5]。它起初被單一認為是BRAF抑制劑，后來發(fā)現(xiàn)是CRAF、BRAF、血管內(nèi)皮生長因子受體、酪氨酸激酶受體等多個激酶的抑制劑，缺乏選擇性。同時索拉菲尼在有著最高BRAF突變率的黑色素瘤的治療中缺乏有意義的臨床活性。在腎癌治療中，積累的經(jīng)驗也提示索拉菲尼僅用作抗血管生成，而缺乏臨床上BRAF抑制劑的功效[12]。在NSCLC治療中，索拉菲尼作為抗血管形成因子聯(lián)合化療使用[13]，同樣也缺乏臨床功效。第二代是以PLX4032為代表的小分子高選擇性BRAF抑制劑，尤其在BRAF基因V600E突變黑色素瘤的III期臨床試驗[14]中取得明顯療效。PLX4032有著高度選擇性，特異性地抑制BRAF（V600E）突變型細胞ERK磷酸化作用，而對BRAF野生型無抑制作用[14]。在BRAF（V600E）突變黑色素瘤模型中以及其異種移植臨床隨訪研究[15,16]中，PLX4032被證實能夠強有力地抑制BRAF信號傳導，包括誘導細胞周期停滯以及細胞凋亡。另外，原發(fā)的及繼發(fā)的PLX4032耐藥問題有待研究，信號通路的轉換或許是導致耐藥的最可能因素。所以同時抑制多種不同通路的聯(lián)合治療或許能保證更好的療效。雖然PLX4032的毒性反應很低，但是在黑色素瘤的治療中其誘發(fā)角化棘皮瘤及皮膚鱗狀細胞癌等副作用值得關注[17]。

BRAF在NSCLC中的突變率約為3%，其中半數(shù)是非V600E突變，提示NSCLC的BRAF突變從本質(zhì)上與黑色素瘤不同。然后針對靶向治療藥物治療黑色素瘤BRAF（V600E）突變研究已經(jīng)比較深入和成熟，而在NSCLC中的療效尚待完善。對BRAF（V600E）突變型細胞高度選擇性的靶向藥物尤其是PLX4032在NSCLC中的作用有待進一步研究，同時也應該注意研發(fā)其它高選擇性的靶向治療藥物。

5.3 BRAF基因在NSCLC表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）治療中的預測作用 目前EGFR突變已經(jīng)被確立為評估EGFR-TKI（吉非替尼和厄洛替尼）治療敏感性的有效預測指標，有效率高達70%[18]。一項針對未經(jīng)治療的轉移性NSCLC患者的前瞻性隨機對照III期研究（Iressa Pan-Asia Study, IPASS）[18]發(fā)現(xiàn)，吉非替尼一線治療比順鉑輔助化療對EGFR突變陽性的肺癌患者擁有更長的無進展生存期。與EGFR突變預測TKI療效陽性價值相反，BRAF突變預示抗EGFR靶向治療的耐藥性。癌基因BRAF能使細胞對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥。檢測BRAF臨床功效的回顧性分析[19]表明西妥昔單抗及帕尼單抗對BRAF突變的患者無效。

6 總結

在腫瘤治療進入基于分子標志物的“個體化”醫(yī)學時代，需要對腫瘤細胞攜帶的復雜基因突變進行系統(tǒng)的分子分型。近年來對NSCLC研究熱點，更多地著重于對基于特異的基因突變的NSCLC臨床相關分子事件的進一步細分。BRAF突變在NSCLC中的意義越來越受到廣大學者的關注。

2002年英國腫瘤基因組計劃的科學家Davies等[8]對來自于530個不同腫瘤細胞株的基因組DNA進行篩查，首次在人體內(nèi)證實有43株細胞發(fā)生了BRAF基因突變，且在所有腫瘤中的發(fā)生率是8%，而在歐洲人群中肺癌中是3%。在一項針對非白種人的研究[20]中，日本肺腺癌患者BRAF突變僅有1%。近年來研究提示癌基因BRAF能使細胞對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥。

繼續(xù)對BRAF基因突變進行深入研究可望為闡明NSCLC致病的分子機制以及尋找新的治療方法提供思路，為研究NSCLC的分子靶向治療提供理論依據(jù)。其對于NSCLC的進展及預后的意義尚不明確，其能否作為NSCLC TKI治療耐藥判斷的有效手段，尚待進一步研究證實。