RP－HPLC法測(cè)定香蓮霜中丁香酚含量

吳釘紅，吳秀英，鄭少文，袁小紅＊

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510380）

香蓮霜為廣東省中醫(yī)院新開發(fā)的醫(yī)院制劑，含有丁香、廣藿香、黃連等中藥材，具有清熱燥濕、殺蟲止癢的功效，臨床用于治療皮膚真菌病、外陰陰道念珠菌病和細(xì)菌、滴蟲性陰道炎。丁香是該制劑中的君藥，有效成分丁香酚具有抑菌消炎、除臭、防腐抗病毒、清熱解暑、鎮(zhèn)痛、抗驚厥的作用［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，丁香還是一種廣譜抗菌藥［2］。本實(shí)驗(yàn)選擇丁香酚為指標(biāo)成分，采用反相高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，確定該霜?jiǎng)┲卸∠惴拥暮?。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇合適的色譜條件使丁香酚跟其他成分和基質(zhì)分離開來(lái)，通過(guò)樣品回收率考察該方法的可行性。為該制劑的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，確保該制劑的安全有效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（waters，含600型液相色譜泵，2998PAD檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；C18色譜柱（diamonsil，250mm×4.6mm ，5μm）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS224S）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥

丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：725－202929，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；香蓮霜（醫(yī)院制劑，批號(hào)：20100126、2010022201、2010022202、2010031201、20100311、2010031202、20100305、2010031001、20101203、20100313）。試藥：本實(shí)驗(yàn)除高效液相所用甲醇、乙腈為色譜純、水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含丁香酚0.273mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 供試品溶液的制備

取本品1g，精密稱定，置于100mL的具塞錐型瓶中，精密加無(wú)水乙醇50mL，稱定重量，超聲提取20min，放置常溫后，置于2℃～10℃的冰箱中，放置過(guò)夜。第2天取出，放置常溫，再稱定重量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件［3］

色譜柱為C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－水（70∶30）；流速為1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；進(jìn)樣量10μL。此條件下丁香酚與其他組分達(dá)到基線分離，分離度R＞1.5，理論板數(shù)按丁香酚計(jì)算均大于3000。丁香酚保留時(shí)間約8min。

2.4 線性關(guān)系考察

取0.273mg／mL的丁香酚對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別進(jìn)樣1.0、5.0、10.0、20.0、40.0μL，按上文所述色譜條件操作，記錄色譜圖和峰面積。以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量C（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y＝1262482.39X－11937.64，r＝0.9999。結(jié)果表明丁香酚在0.027328～1.09312μg／mL范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性曲線基本上過(guò)原點(diǎn)，可用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液各10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按前文所述色譜條件操作，計(jì)算丁香酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD＝0.21%，表明精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液，分別在0、2 、4、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算丁香酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD＝0.47%。表明用本方法處理的溶液在室溫放置24h穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)的5份樣品，照“2.2”項(xiàng)下的制備方法，進(jìn)行操作測(cè)定，計(jì)算丁香酚含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，香蓮霜中丁香酚的平均含量為4.2006mg／g，RSD＝0.31%，表明方法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知丁香酚含量的樣品（4.2006mg／mL）6份，再分別精密加入一定量的對(duì)照品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為96.16，RSD＝1.47%，表明方法回收率較好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丁香酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 專屬性實(shí)驗(yàn)

按處方制備缺丁香的陰性對(duì)照樣品，照供試品溶液的處理方法制備陰性供試品溶液。對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣各10μL，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明陰性供試品溶液在丁香酚色譜峰位置處無(wú)相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明在此色譜條件下，其它藥材及輔料對(duì)樣品含量測(cè)定無(wú)影響。

圖1 高效液相色譜

2.10 含量測(cè)定

精密稱取10個(gè)批號(hào)的香蓮霜各1g，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法，分別進(jìn)行處理，精密吸取供試品溶液各10μL，依法測(cè)定，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算樣品中丁香酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 香蓮霜中丁香酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

取丁香酚對(duì)照品溶液，在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［4，5］，故選擇280nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖2 丁香酚對(duì)照品紫外光譜

用70%甲醇作為提取溶劑，色譜峰出現(xiàn)拖尾，峰形較寬，理論塔板數(shù)低。而用無(wú)水乙醇作為提取溶劑，色譜峰峰形好，理論塔板數(shù)高，故選用無(wú)水乙醇為溶媒。同時(shí)比較了索式提取、超聲提取、回流提取三種提取方法，結(jié)果表明，用無(wú)水乙醇超聲提取20min效果最佳。

結(jié)果表明，本研究建立的反相高效液相含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)單快速，精密度高，穩(wěn)定性較好，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于香蓮霜中丁香酚的含量測(cè)定。

［1］RIE W，KEUNG WM.Rhizoma acori graminei and its active principles protect PC－12cells from the toxic effect of amyloidbeta peptide［J］.Brain Res，2003，963（1－2）：282－289.

［2］KIM HM，LEE EH，HONG SH，et al.Effect of Syzygium aromaticum extract on immediate hypersensitivity in rats［J］.J Ethnopharmacol，1998，60（2）：125－131.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典高效液相色譜圖集［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：140.

［4］余小平.高效液相色譜法測(cè)定丁香中丁香酚的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28（6）：975－976.

［5］張少?gòu)?，饒華孟.高效液相色譜法測(cè)定丁硼乳膏中丁香酚的含量［J］.海峽藥學(xué)，2009，21（10）：41－42.