輕度高尿酸血癥小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

黃智勇 謝 紅

解放軍第175醫(yī)院腎內(nèi)科，福建省漳州市 363000

高尿酸血癥是一種常見病，多種原因可導(dǎo)致血尿酸水平升高，包括飲食、腎臟排泄受損和過多內(nèi)源性嘌呤的分泌，基因因素也起到一定作用。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，以及對(duì)高尿酸血癥認(rèn)識(shí)的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率明顯增加［1］。人們不僅認(rèn)識(shí)到痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和尿酸鹽結(jié)晶對(duì)腎臟的損傷，而且眾多研究表明，尿酸升高與高血壓、腎臟疾病、代謝綜合征、腦卒中、胰島素抵抗、脂代謝紊亂、心血管事件及全因死亡率成獨(dú)立正相關(guān)［2，3］。由于越來(lái)越多的證據(jù)提示尿酸與高血壓、代謝綜合征、心血管疾病等之間的聯(lián)系，似乎對(duì)高尿酸血癥的治療將使伴有其他危險(xiǎn)因素的患者獲益。然而，在臨床實(shí)踐中，對(duì)于血尿酸水平輕度升高的無(wú)癥狀患者是否給予治療仍存在爭(zhēng)議。本研究擬通過建立高尿酸血癥動(dòng)物模型，了解高尿酸血癥時(shí)機(jī)體狀態(tài)的變化，探討無(wú)癥狀高尿酸血癥時(shí)是否需要早期干預(yù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 雄性4月齡昆明小鼠20只，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，自然晝夜采光。尿酸（美國(guó)Sigma公司），氧嗪酸鉀（美國(guó)Sigma公司），一氧化氮（NO）試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司），小鼠血管性假血友病因子（vWF）ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司），過氧化氫（H2O2）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) 血尿酸（UA）、尿素氮（UN）采用日立7150型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。血NO、vWF和H2O2檢測(cè)按相關(guān)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。腎臟和大血管PAS或HE染色，光鏡下觀察。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。20只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組各10只。模型組腹腔注射氧嗪酸鉀250mg／（kg·d）（氧嗪酸鉀難溶于生理鹽水，60℃水浴成混懸液，混懸液恢復(fù)至室溫后使用）和尿酸250mg／（kg·d）（混懸液），對(duì)照組注射同等體積生理鹽水，連續(xù)14d。摘眼球采血，分離血清后行UA、UN、NO、vWF、H2O2檢測(cè)。留取腎臟、腹主動(dòng)脈，10%甲醛固定，PAS或HE染色，光鏡下觀察腎臟組織和大血管形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 血清UA、UN測(cè)定結(jié)果 腹腔注射氧嗪酸＋尿酸14d，模型組血UA水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。但2組小鼠血UN變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖1B。

2.2 血清H2O2測(cè)定結(jié)果 以氧嗪酸＋尿酸腹腔注射制備高尿酸血癥小鼠模型，模型組血H2O2水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 高尿酸血癥小鼠模型的建立 圖2 對(duì)照組與模型組血清H2O2測(cè)定結(jié)果比較注：圖1 A：模型組血尿酸水平明顯升高（＊P＜0.05，與對(duì)照組比較，n＝10）。B：模型組與對(duì)照組比較，血尿素氮水平無(wú)顯著差異。圖2：高尿酸血癥小鼠血H2O2水平升高（＊P＜0.05，與對(duì)照組比較，n＝10）。

2.3 血清NO、vWF測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組血NO水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3A。血vWF水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 模型組與對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)比較注：A：高尿酸血癥模型小鼠血NO水平降低（＊P＜0.05，與對(duì)照組比較，n＝10）。B：高尿酸血癥模型小鼠血vWF水平升高（＊P＜0.05，與對(duì)照組比較，n＝10）。

2.4 組織病理 對(duì)照組與模型組均未見明顯腎小球、腎小管及腎間質(zhì)小動(dòng)脈病變，小管管腔無(wú)結(jié)晶樣物質(zhì)沉積，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)物異常，見圖4A、圖4B、圖4C。血管內(nèi)皮細(xì)胞排列于血管內(nèi)膜下，內(nèi)膜無(wú)增厚，血管壁無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯病變，見圖4D。

圖4 對(duì)照組與模型組病理學(xué)結(jié)果比較注：模型組腎小球（A，PAS染色，×400）、小管間質(zhì)（B，PAS染色，×400）、間質(zhì)小動(dòng)脈（C，PAS染色，×400）和大動(dòng)脈（D，HE染色，×400）與對(duì)照組比較均無(wú)明顯病理學(xué)改變。

3 討論

血尿酸水平的變化與臨床多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，特別是與高血壓、糖尿病、肥胖、代謝綜合征等有密切聯(lián)系［4］。當(dāng)尿酸生成過多、排出障礙或者二者兼而有之，血尿酸水平升高超出正常范圍，則出現(xiàn)高尿酸血癥。隨著生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化［1］。大量流行病學(xué)資料提示高尿酸血癥是獨(dú)立于高血壓、糖尿病、肥胖等危險(xiǎn)因素之外的導(dǎo)致慢性腎臟病和心血管疾病的危險(xiǎn)因素，高水平血尿酸可通過氧化應(yīng)激，增加ROS生成，誘導(dǎo)炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)血管病變的發(fā)生發(fā)展［5］。然而，對(duì)無(wú)癥狀高尿酸血癥的積極治療卻存在爭(zhēng)議。

氧化應(yīng)激是機(jī)體ROS產(chǎn)生和作用于生物系統(tǒng)對(duì)ROS解毒或修復(fù)損傷之間的一種不平衡。目前公認(rèn)的是氧化應(yīng)激在內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能變化中發(fā)揮了重要的作用，是內(nèi)皮功能紊亂的一個(gè)主要機(jī)制［6］。當(dāng)ROS產(chǎn)生超過機(jī)體的抗氧化防御能力則產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能。H2O2是體內(nèi)最常見的一種氧自由基，參與細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過程，是造成組織器官損傷的主要ROS成分。在實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)模型組血UA水平升高，且H2O2水平也明顯升高，提示高尿酸小鼠機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。NO在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集、抗炎等方面起著重要作用，NO生物活性的下降是內(nèi)皮功能障礙的一個(gè)主要部分。vWF主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中合成和儲(chǔ)存，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，vWF合成釋放增加。因此vWF是反映內(nèi)皮細(xì)胞受損的分子標(biāo)志物之一。本實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到模型組血vWF水平升高，NO水平下降，提示內(nèi)皮細(xì)胞受損，功能障礙。即高尿酸血癥小鼠存在明顯氧化應(yīng)激狀態(tài)，內(nèi)皮功能受損。

目前制備高尿酸血癥模型主要有使用次黃嘌呤、腺嘌呤、尿酸鹽、尿酸酶抑制劑等方法。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，氧嗪酸聯(lián)合尿酸腹腔注射，可在較短時(shí)間內(nèi)明顯升高血尿酸水平，且無(wú)腎功能損害，腎小球、腎小管間質(zhì)及大血管均無(wú)明顯病理改變，可用于無(wú)癥狀輕度高尿酸血癥模型制備。

綜上所述，本研究通過制備輕度高尿酸血癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)輕度高尿酸血癥時(shí)氧化應(yīng)激即已增強(qiáng)，內(nèi)皮功能受損。所以，應(yīng)考慮積極治療血尿酸輕度增高的無(wú)癥狀患者，以利于糾正患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，延緩心腎等疾病的發(fā)生。

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