維生素E對約氏瘧原蟲感染BALB/c小鼠早期免疫應(yīng)答的抑制效應(yīng)

延 娟 劉 軍 李 瑩 潘艷艷 鄭 麗 曹雅明 (中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽110001)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。最新數(shù)據(jù)顯示，目前世界上有109個國家發(fā)生瘧疾流行，全球處于瘧疾風(fēng)險的33億人群中，有2.7億人患瘧疾，其中將近100 萬人死亡［1］。

維生素E(Vitamin E，VE)是細胞內(nèi)和細胞外的抗氧化劑，其在抗寄生蟲方面的作用多年來一直存有爭議。早在上一世紀(jì)，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VE與免疫系統(tǒng)之間存在某種聯(lián)系。有文獻報道給動物補飼高水平VE后，可增強T淋巴細胞的增殖，促進吞噬細胞的吞噬作用，同時提高細胞因子產(chǎn)生和抗體水平，從而有利于疾病的恢復(fù)［2］。同時也有研究顯示，VE可有效地增強新生兒的體液免疫應(yīng)答，進而有效的抵抗新生兒期的感染［3］。

然而近年來，關(guān)于瘧疾和VE的研究發(fā)現(xiàn)，飲食中補充VE可加重C57小鼠的腦瘧癥狀;同時，在動物研究中發(fā)現(xiàn)，飲食中缺少VE可抵抗約氏瘧原蟲的感染。有文獻報道，感染瘧疾后紅細胞膜表面的維生素E濃度降低，從而造成紅細胞、瘧原蟲或者是瘧原蟲DNA的氧化破壞［4］;目前關(guān)于VE和瘧疾之間的相關(guān)免疫機制尚不清楚。為此，本研究利用我們成功建立的P.y17XL易感鼠瘧模型，動態(tài)地觀察了VE對P.y17XL易感小鼠免疫應(yīng)答的影響，以期明確VE在P.y17XL感染早期的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、瘧原蟲及主要試劑 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供(許可證編號：SCXK京200420001);P.y17XL(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈);PE-anti-CD69(clone H1.2F3BD Pharmigen)、FITC-anti-CD4(clone GK1.5，BD Pharmigen)、FITC-anti-CD11c(clone HL3，BD Pharmigen)、PE-anti-CD11b(clone M1/70，BD Pharmigen)、percp-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2，BD Pharmigen)、anti-TLR9(clone 5G5，hycultbiotech)和 PE-conjugated streptavidin(clone streptavidin，Biolegend)、FctⅢ/Ⅱ封閉抗體(clone 2.4G2，BD Pharmigen)、VE(sigma)。

無人機測繪技術(shù)一大優(yōu)勢是可以搭載高清攝像設(shè)備進行高空遙感拍攝作業(yè)。首先，在工程測量過程中，運用無人機測繪技術(shù)對工程項目周圍的水文地質(zhì)及地理情況等進行觀測，通過無人機高清攝像設(shè)備進行航拍，影像具有更高的清晰度，分析數(shù)據(jù)更加可靠，監(jiān)測內(nèi)容更加全面。其次，無人機測繪技術(shù)能將拍攝圖片放大，在遙感測量時，通過調(diào)控攝像軟件系統(tǒng)，能夠進行不同環(huán)境下的監(jiān)測，從而使攝像過程中存在的誤差問題得到更好的控制。最后，無人機測繪技術(shù)在工程測量中，機動性明顯，搭載航拍設(shè)備或攝像系統(tǒng)能夠很好地實現(xiàn)高清攝像，還可以定時定位監(jiān)測設(shè)置，優(yōu)化了無人機測繪的整體效果充分發(fā)揮其在工程測繪中的優(yōu)勢。

2.1兩組小鼠感染后不同時間的原蟲血癥水平和生存率 如圖1A所示，于感染后第2天，兩組小鼠外周血中均出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細胞。感染后第3天，原蟲血癥水平均為2% ～5%。隨后，與NC組小鼠相比，VE組小鼠原蟲血癥水平顯著升高，第6天時達到70%，同時如圖1B所示，在感染后第6天VE組小鼠的生存率只有30%，而NC組的生存率達到70%。CD11b+DCs，mDCs)的數(shù)量 如圖2A所示，與感染前相比，兩組小鼠pDCs的數(shù)量于感染后第3天開始升高，于感染后第5天達到最高水平，然而，VE組小鼠脾pDCs的數(shù)量在感染后一直低于NC組，兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。如圖2B所示，mDCs從感染后第3天開始升高，并于感染后第5天達到最高水平，且在感染后第5天，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

1.2實驗動物感染BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率，并每日觀察生存率。

每份樣品用FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

2.4兩組小鼠感染后不同時間巨噬細胞(F4/80+)的數(shù)量 如圖4所示，與感染前相比，NC組小鼠巨噬細胞數(shù)量從感染后3天開始升高，感染后第5天達到最高，而VE組小鼠巨噬細胞的數(shù)量和感染前相比，無明顯變化。且與NC組相比，感染后3天、5天，VE組明顯低于NC組(P＜0.05)。

通過對中老年糖尿病合并腦梗塞患者實施CT診斷后，取得顯著效果，部分患者伴有意識障礙、失語、肢體癱瘓等情況，患者自身血糖難以控制，其病情易反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致患者病情嚴(yán)重，高血糖患者自身腦水腫情況十分嚴(yán)重，應(yīng)對患者飲食密切注意，嚴(yán)格對飲食中糖類攝入有效控制，才能顯著降低腦梗塞死亡性，通過控制患者血糖，對原發(fā)病實施積極治療，具有顯著效果，能改善中老年糖尿病合并腦梗塞患者的預(yù)后[4] 。

每份樣品用FITC-anti-F4/80另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入FITC-anti-F4/80，離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞流式細胞儀進行檢測。

每份樣品用FITC-anti-CD11c PE-anti-TLR9另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再用FITC-anti-CD11c標(biāo)記，固定透膜后再用biotinylated anti-TLR9和 PE-conjugated streptavidin標(biāo)記細胞。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

1.3動物分組與藥物處理 BALB/c小鼠隨機分為2組：大豆油處理組(NC組)和VE處理組，600 mg/kg(VE組)，每組20只小鼠，分別于感染前10天連續(xù)每天一次灌胃大豆油或VE 0.2 ml。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標(biāo)本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 感染后不同時間原蟲血癥水平和生存率Fig．1 Parasitemia and survival rate of BALB/c mice in different time post infectionNote：A.Parasitemia;B.Survival rate.*.P＜0.05.

2.2兩組小鼠感染后不同時間脾臟 DCs亞群(CD11c+CD45R/B220+DCs，pDCs 和 CD11c+

2 結(jié)果

隨著人們生活水平的日益提高，人們對于精神生活也越來越重視。這時群眾文化活動就成了他們首要選擇的方式，其中群眾美術(shù)文化成為人們追捧的群眾文化活動之一。高水平的群眾美術(shù)輔導(dǎo)活動有利于提高群眾的審美能力。美術(shù)的發(fā)展經(jīng)過了長時間的積累和進化，在傳承和發(fā)展的同時，美術(shù)用它自身的魅力，影響著一代又一代的人們。高水平的群眾美術(shù)活動可以豐富人們的生活，給人們帶來心靈上的凈化。

圖2 感染后不同時間脾臟DCs亞群的數(shù)量Fig．2 The percentage of the subsets of DCs in different time post infection

2.3兩組小鼠感染后不同時間脾臟CD11c+DCs細胞TLR9的表達水平 如圖3所示，與感染前相比，兩組小鼠TLR9的表達水平于感染后第3天、5天升高，然而，與NC組小鼠相比，VE組TLR9的表達無顯著差異。

2.5兩組小鼠感染后不同時間脾臟T細胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平 如圖5所示，與感染前相比，兩組小鼠活化的T細胞的數(shù)量于感染后3天、5天均明顯升高，且在感染后第5天兩組之間具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 感染后不同時間脾臟CD11c+DCs細胞TLR9的表達水平Fig．3 The percentage of CD11c+DCs expressing TLR9 in splenocytes in different time post infection

圖4 感染后不同時間脾臟巨噬細胞的數(shù)量Fig．4 The percentage of macrophages in different time post infection

1.4流式細胞儀檢測脾臟DCs亞群、巨噬細胞、TLR9的表達水平及T細胞的活化水平 無菌取出感染前(0天)和感染后第3、5天小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107ml-1。每份樣品用FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入 FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220，離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

如今的世界工業(yè)已經(jīng)進入第四次革命，德國“工業(yè)4.0”就是具體的表現(xiàn)，是對于“工業(yè)1.0”(機械化)、“工業(yè)2.0”(電氣化)、“工業(yè)3.0”(信息化)的延展。新經(jīng)濟環(huán)境下制造業(yè)就是將智能化的新制造方式和具體的行業(yè)結(jié)合，實現(xiàn)個性化、定制化的設(shè)計、制作、物流平臺一條龍服務(wù)。我國的“制造2025”戰(zhàn)略中，也是將信息技術(shù)和制造技術(shù)深層次融匯，從要素驅(qū)動轉(zhuǎn)向創(chuàng)新驅(qū)動。由以往的能源損耗多、廢棄物產(chǎn)生多的粗糙模式變成綠色環(huán)保的模式，從低價模式變成性價比高模式，從生產(chǎn)模式變成服務(wù)模式。

近年來，血管瘤切除術(shù)在臨床中備受醫(yī)生和廣大患者的肯定和信賴，手術(shù)操作微創(chuàng)且痛苦少，恢復(fù)速度快，縮短患者住院時間[5] 。但手術(shù)治療是入侵式治療，會有一定風(fēng)險，給予患者科學(xué)有效的護理指導(dǎo)，才能確保治療效果[6] 。

圖5 感染后不同時間脾臟T細胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平Fig．5 The activation of CD4+CD69+T cells in different time post infection

3 討論

人體和動物模型研究結(jié)果均已表明：紅內(nèi)期瘧原蟲和固有免疫細胞之間的早期相互作用對于抗瘧適應(yīng)性免疫應(yīng)答的建立至關(guān)重要［5，6］，因此，深入理解瘧疾免疫的調(diào)節(jié)機制無疑具有重要的科學(xué)意義。

不同遺傳背景的小鼠在感染同種瘧原蟲時，其免疫應(yīng)答發(fā)生時相、強度明顯地影響著感染進程和最終結(jié)局。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)表明，BALB/c感染P.yl7XL后不能有效地建立Th1免疫應(yīng)答，紅內(nèi)期瘧原蟲的爆發(fā)性增殖是BALB/c小鼠死亡的根本原因［7］。本實驗結(jié)果表明，VE補充后，雖然死亡率沒有明顯變化，但其感染率明顯高于對照組。由此提示VE補充后可進一步加重BALB/c小鼠的P.yl7XL感染。

目前，繼電保護裝置整機生產(chǎn)測試主要停留在手動測試或借助商用測試儀（如博電、昂立）和自主開發(fā)的測試儀進行的半自動測試階段。無論哪種測試方案，整個測試過程都過于依賴測試工程師的參與：測試工程師要不斷根據(jù)保護裝置的類型選擇測試線，并選擇相關(guān)功能進行測試。缺點是測試過程復(fù)雜，勞動強度較大，測試時間稍長。為此，本文深入研究智能電網(wǎng)保護裝置生產(chǎn)過程的各個子環(huán)節(jié)，通過對生產(chǎn)測試子過程的不斷集成及優(yōu)化，生產(chǎn)過程大數(shù)據(jù)的綜合利用，整機測試儀的技術(shù)改進，氣動系統(tǒng)的靈活控制等，設(shè)計了繼電保護裝置整機智能測試系統(tǒng)，實現(xiàn)了繼電保護裝置的智能化大生產(chǎn)測試。

有關(guān)文獻報道，DCs明顯決定著瘧疾感染過程中Th應(yīng)答的形式和效應(yīng)強度［8］。本研究通過免疫調(diào)節(jié)劑VE對P.yl7XL易感小鼠BALB/c進行預(yù)先給藥處理，發(fā)現(xiàn)作為活化初始T細胞的唯一抗原提呈細胞，兩個重要細胞亞群活化均受到抑制，同時T細胞的活化也受到影響。

也有文獻表明，DCs成熟和效應(yīng)功能持續(xù)發(fā)揮的重要前提是TLR對于病原相關(guān)分子模式(PAMPs)的識別。研究表明，TLR9可通過識別瘧色素誘導(dǎo)前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，同時上調(diào)共刺激分子，進而誘導(dǎo)DCs的成熟和分化［9］。然而，在本實驗中補充 VE后兩組小鼠TLR9的表達無明顯差異。

除DCs外，大量研究表明，單核巨噬細胞明顯影響著瘧原蟲的感染進程。巨噬細胞既可作為非特異免疫細胞發(fā)揮非特異性吞噬、殺傷作用，也可參與介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗原提呈和免疫調(diào)節(jié)的重要作用。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)證實，活化的巨噬細胞在約氏瘧原蟲感染早期遏制瘧原蟲在紅內(nèi)期的爆發(fā)性增殖，有效控制原蟲血癥的迅速上升［10］。然而在本實驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在感染后5天，VE組小鼠巨噬細胞的數(shù)量明顯減少，且與感染前相比，補充VE后巨噬細胞的數(shù)量在感染后無有意義升高。由此提示，在瘧疾感染中，VE預(yù)處理可有效抑制巨噬細胞的活化，從而影響機體對瘧原蟲的殺傷。

綜上，VE作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在瘧疾感染的過程中可通過抑制固有免疫應(yīng)答，進而加重瘧疾感染。

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