水蛭、斑蝥對小鼠移植肉瘤S180血管形成的影響＊

吳秋玲，盧宏達，郭繼龍，孔慶志△

(1.山西中醫(yī)學院，太原 030024;2.武漢市中心醫(yī)院，武漢 430014)

1 材料

1.1 動物

昆明種小鼠70只，體重為20g±2g，6～8周齡，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前分籠飼養(yǎng)2d，實驗過程動物自由攝食、攝水。

1.2 瘤株

瘤株為小鼠腹水型肉瘤細胞株S180細胞，由山西醫(yī)科大學藥物所腫瘤室提供，常規(guī)復蘇傳代培養(yǎng)。

1.3 主要藥品與試劑器材

1.3.1 藥品 水蛭、斑蝥由山西省中醫(yī)藥研究院中藥房提供，經(jīng)山西中醫(yī)學院中藥系專家鑒定質量符合實驗要求。水蛭為水蛭科動物柳葉螞蟥whitmannia acranulata Whitman的干燥體。斑蝥為芫菁科芫菁屬昆蟲南方大斑蝥Mylabris phalerata Pall的干燥蟲體。

1.3.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(含2.05mmol L-谷氨酰胺)，購自HyClone公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程研究所;二甲基亞砜DMSO，購自北京索萊寶科技有限公司;VEGF免疫組化檢測試劑盒，購自武漢博士德生物公司;鼠抗人CD34單克隆抗體，為即用型，S-P超敏試劑盒為武漢博士德生物公司產品;基質金屬蛋白酶MMP-9兔抗多克隆抗體(BA0573)，武漢博士德生物工程有限公司;Powervision免疫組化檢測試劑(PV-6001/6002)，北京中山生物技術有限公司;濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9017/9018)，武漢博士德生物工程有限公司;即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3.3 器材 超凈工作臺BBS-DSC，上海巴艾貝斯;AnKe 80-2C臺式離心機，北京醫(yī)用離心機廠;Heal force二氧化碳培養(yǎng)箱HF90型;電熱恒溫孵育箱，DHP-9162上海一恒科技有限公司;倒置熒光顯微鏡圖像采集處理系統(tǒng)DP70IPP5.11，日本奧林巴斯。

2 方法

2.1 水蛭、斑蝥濃縮液的制備

將水蛭、斑蝥(去頭、足、翅)加水浸泡30min，按常規(guī)制備各水煎液，再濃縮成相當于含水蛭生藥1g/ml的濃縮液和相當于含斑蝥生藥3mg/ml的濃縮液。4℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前搖勻。

2.2 荷瘤小鼠模型的建立

2.2.1 腫瘤細胞懸液的制備 體外復蘇培養(yǎng)S180細胞，將S180細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，含青霉素1×105u/L和鏈霉素100mg/L中，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞的指數(shù)生長期收集細胞，1000轉速離心，PBS洗滌離心去上清，無菌生理鹽水稀釋，調整到2～3×106/ml。隨機選取10只6～8周齡健康小鼠，每只用上述細胞懸液0.4ml進行腹腔注射，約10d后接種小鼠出現(xiàn)腹部明顯凸出、漲大，將小鼠頸椎脫臼處死，超凈工作臺內無菌抽取乳白色腹水液，用生理鹽水稀釋，鏡檢計數(shù)腫瘤細胞，調整細胞數(shù)為1～2×107/m1備用。

2.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 60只小鼠，每只小鼠于左上肢腋窩消毒后皮下接種0.2ml的腫瘤細胞懸液。

2.2.3 分組與給藥 小鼠接種腫瘤后隨機分為水蛭高低劑量組、斑蝥高低劑量組、生理鹽水對照組5組，各組小鼠分別稱重。

計算小鼠給藥劑量，各組小鼠給藥按照臨床等效劑量，根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式[1]計算:dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3換算，公式中dB為動物劑量(mg/kg)，dA為人的劑量(mg/kg)，RB動物體型系數(shù)，小鼠為59;RA人體型系數(shù)為100;WB動物體重(kg)，WA人體重(kg)。成人體重按60kg每天口服水蛭9g或斑蝥0.045g，按照以上所述算得小鼠每天給藥劑量。水蛭高劑量組為0.4ml/10g/d)，水蛭低劑量組為0.2ml/10g/d，斑蝥高劑量組為2.5ml/10g/d)，斑蝥低劑量組為1.25ml/10g/d，陰性對照組每只0.4ml生理鹽水/d。分別給小鼠灌胃每天2次，連續(xù)給藥10d。

2.2.4 取材、石蠟切片、HE染色 用藥后第10天脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，取材、石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3 觀察指標及觀察方法

2.3.1 瘤重及抑瘤率 腫瘤抑瘤率=(對照組平均瘤重－用藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

2.3.2 瘤組織形態(tài)學觀察

2.3.3 腫瘤組織內微血管密度MVD的測定MVD的測定(CD34陽性判斷標準)按參考文獻方法[2]，凡是染成棕黃色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為1個血管計數(shù)，凡管腔帶有較厚肌層包繞或管腔＞8個紅細胞的血管區(qū)域不予計數(shù)。計數(shù)方法:先用100倍視野內選取3個血管高密度的區(qū)域，再轉到200倍視野計數(shù)每個區(qū)域的血管數(shù)量，取3個數(shù)值的平均值作為微血管密度(MVD)。

2.3.4 腫瘤組織內VEGF免疫組化測定VEGF免疫組化測試根據(jù)試劑說明書進行，切片、免疫組化染色方法同上。判斷結果如下:陽性細胞呈棕黃色，免疫組化染色評分標準按Rahman等報道[3]的方法進行。VEGF的評分標準是:根據(jù)著色細胞的比例，即染色范圍及染色強度，染色范圍根據(jù)陽性細胞比率分為0至4級:陰性0分;陽性細胞率在1%～25%為1分;陽性細胞率在26%～50%為2分;陽性細胞率在51%～75%為3分;陽性細胞率在76%～100%為4分。根據(jù)染色強度分為0至3級:陰性為0分;弱陽性1分;中等強度2分;強陽性3分，兩者得分相加之和為最后評分。

2.3.5 基質金屬蛋白酶(MMP-9)檢測 檢測采用ABC法。切片置載物臺上，采用物鏡40×，以Image-Pro Plus圖像分析軟件，參照文獻報道計分法給予評分[4]:隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)細胞膜或漿的染色程度及染色細胞的百分比分析評分:基本不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色較深為3分;著色細胞占計數(shù)細胞的百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。分別將每張切片著色度得分和著色細胞百分比得分各自相乘是最后得分?？偡值?～1分評為陰性(－)，2～3分評為弱陽性(+)，4～5分評為中陽性(++)，≥6分評為強陽性(+++)。

2.4 統(tǒng)計方法

應用SPPS18.0軟件進行統(tǒng)計，各組實驗數(shù)據(jù)計量資料均以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析進行顯著性檢驗;等級資料比較用Kruskal-wallis秩和檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜0.01為差異具有顯著性。

3 結果

3.1 抑瘤率

表1顯示，在剝離瘤組織時發(fā)現(xiàn)，對照組的瘤體明顯增大，界限不清，不易剝離，血管分布豐富;而用藥組瘤體相對較小，瘤組織色發(fā)白，血管分布相對少。實驗結果顯示，與對照組比較水蛭高低劑量和斑蝥高低劑量組均有明顯的抑瘤作用，瘤重明顯減輕(P=0.0118，0.0013，0.0001，0.0002);水蛭高低劑量和斑蝥高低劑量組的抑瘤率與對照組相比，均P＜0.01。

3.2 腫瘤組織形態(tài)學觀察

與對照組比較，各用藥組小鼠腫瘤體積較小，形狀較規(guī)則。經(jīng)HE染色后切片觀察，對照組腫瘤組織成片狀、巢狀生長，腫瘤細胞排列較密集，腫瘤細胞異型性較多，瘤組織內小血管較豐富。水蛭、斑蝥組均可見不同程度的片狀壞死區(qū)，瘤細胞密度減小，結締組織增多，瘤組織及其周圍新生微血管數(shù)目減少，其中以斑蝥高劑量組為最明顯。斑蝥高劑量組部分腫瘤組織中可見有凋亡細胞。

表1 水蛭、斑蝥對S180肉瘤重量及抑瘤率的影響

表1 水蛭、斑蝥對S180肉瘤重量及抑瘤率的影響

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;瘤重t=2.606，3.396，4.160，4.056;抑瘤率t=－12.070，－15.285，－18.769，－18.740。用藥組等劑量比較:▲▲P＜0.01;抑瘤率t=－6.286，－3.455

組別 例數(shù) 瘤重(g) 抑瘤率(%)對 照 組12 1.319±0.351 0斑蝥高劑量組 11 0.984±0.301* 26.11±4.07＊＊斑 蝥 低 劑 量 組 12 0.892±0.294＊＊ 32.34±6.02＊＊水蛭高劑量組 12 0.796±0.245＊＊ 39.71±5.49＊＊▲▲水 蛭 低 劑 量 組 12 0.809±0.337＊＊ 39.65±7.10＊＊▲▲

3.3 水蛭、斑蝥對S180瘤體MVD的影響

表2顯示，經(jīng)免疫組化SABC法染色后的切片，鏡下觀察血管內皮細胞被褐染，對照組可見微血管廣泛分布于組織間質內，水蛭、斑蝥組微血管相對少見。斑蝥高低劑量組、水蛭高劑量組微血管數(shù)目減少較明顯(P=0.0252，P=0.0024和P=0.0483)，水蛭低劑量組微血管數(shù)目和空白對照組相比有減少，但不具有統(tǒng)計學意義(P=0.1476)。

表2 水蛭、斑蝥對S180肉瘤MVD的影響

表2 水蛭、斑蝥對S180肉瘤MVD的影響

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;t=2.303，3.180，2.104

組別 例數(shù) 血管數(shù)目對 照 組12 32.16±11.01斑蝥 高 劑 量 組 11 24.54±4.77*斑蝥 低 劑 量 組 12 23.22±7.36＊＊水蛭 高 劑 量 組 12 25.93±8.69*水 蛭 低 劑 量 組12 28.03±7.35

3.4 水蛭、斑蝥對S180瘤體VEGF表達的影響

表3顯示，VEGF蛋白在S180肉瘤組織中呈高表達。斑蝥高低劑量組和水蛭高劑量組對VEGF的表達有較明顯抑制作用(P=0.0145，0.0420，0.0023)。

表3 水蛭、斑蝥對S180瘤體VEGF表達的影響

表3 水蛭、斑蝥對S180瘤體VEGF表達的影響

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，t=2.5259，2.4062，3.1976;水蛭高低劑量組比較:▲P＜0.05，t=－2.4597

組別 例數(shù) VEGF 表達評分對 照 組12 5.03±0.89斑 蝥 高 劑 量 組 11 4.19±0.75*斑 蝥 低 劑 量 組 12 4.31±0.46*水 蛭 高 劑 量 組 12 3.99±0.58＊＊水 蛭 低 劑 量 組 12 4.79±1.02▲

3.5 水蛭、斑蝥對S180瘤體基質MMP表達影響(表4)

4 討論

中醫(yī)學認為，“癥瘕”、“積聚”的形成與血脈瘀滯、瘀血內結有著密切關系?！鹅`樞·百病始生》曰:“卒然多食飲則腸滿，起居不節(jié)，勞力過度則絡脈傷。腸胃之絡傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相搏，則并合凝聚不得散，而積成矣?！闭f明積證的病機關鍵為血瘀。王清任《醫(yī)林改錯》曰:“肚腹結塊，必有形之血?！痹せ瑝墼凇峨y經(jīng)本義》謂:“積蓄也，言血脈不行，蓄積而成病也?！薄睹麽t(yī)指掌》指出:“若人之氣，循環(huán)周流，脈絡清順流通，焉有瘤之患也”，闡述了同樣的病機特點。關于積聚的治療，《素問·至真要大論》認為:“堅者削之”，“結者散之”。乳巖、石疽、石瘕、腎巖、石癭等，均為有形之腫塊，堅硬而實，治療常在理氣活血、清熱解毒、扶正培本、化痰祛濕等基礎上，兼以軟堅散結以圖其標，消除腫塊。而且腫瘤為痼惡之疾，邪毒蘊結于體內，毒陷邪深，非攻不克，故常用有毒之品，借其性峻力猛以攻伐，即腫瘤防治中常用的“以毒攻毒法”。水蛭、斑蝥可破血逐瘀、軟堅散結，其藥力竣猛，為治療腫瘤的常用藥。

表4 水蛭、斑蝥對S180肉瘤MMP-9的影響

表4 水蛭、斑蝥對S180肉瘤MMP-9的影響

注:P值與對照組比較，秩和統(tǒng)計量為Z=3.3518，3.2510，2.3192，2.7165

組 別例數(shù)視野數(shù) 陰性數(shù) 陽性數(shù)(－)(+)(++)(+++)P 值對 照 組10 50 4 18 15 13斑蝥高劑量10 50 9 28 11 2 P=0.0011斑蝥低劑量10 50 12 25 8 5 P=0.0016水蛭高劑量10 50 10 24 7 9 P=0.0224水蛭低劑量10 50 12 24 5 9 P =0.0078

水蛭味咸、苦，性平，有小毒，歸肝經(jīng)、膀胱經(jīng)?！侗窘?jīng)》:“治惡血、瘀血、月閉，破血癥積聚。”醫(yī)圣張仲景用其祛邪扶正，治療“瘀血”、“水結”之癥，顯示其獨特療效。張錫純贊水蛭“存瘀血而不傷新血，純系水之精華生成，于氣分絲毫無損，而血瘀默然于無形，真良藥也。”水蛭為噬血之物，擅長搜剔瘀血，功能化瘀血而不傷新血，亦不傷氣分，為治瘀血而不傷正氣之藥，優(yōu)于一般的活血化瘀藥。正如張錫純所言，水蛭“遲緩則生血不傷，善入則堅積易破，借其力以消既久之滯，自有利而無害也”。臨床治療腫瘤，凡因屬瘀血阻滯者，無論久病入絡之瘀血或新病驟成之瘀血;也不論血熱煎熬之瘀血，還是寒邪凝結所致之瘀血;不論患者體質強弱，均可用水蛭配伍不同的藥物治療。水蛭廣泛用于治療各種腫瘤及疑難雜癥。

人類用斑蝥治療疾病已有2000多年的歷史，《仁齋直指方論》中明確記載斑蝥可治療癌癥。《本草綱目》記載:“治疝瘕，解疔毒，沙虱毒，猘犬毒，蠱毒，輕粉毒。”《本經(jīng)》中稱其味辛，有大毒，歸肝、胃、腎、大腸和小腸經(jīng)，具有攻毒蝕瘡、逐瘀散結的功效。《別錄》曰其“主疥癬，血積?！睂嶒灱芭R床研究均已證實，斑蝥具有明確的抗癌作用，臨床用于治療多種惡性腫瘤，其優(yōu)勢在于不降低周圍血中白細胞的數(shù)量，且對機體沒有明顯的免疫抑制作用。

腫瘤血管生成與腫瘤的生長、浸潤、轉移及預后有著密切關系[5]。腫瘤生長經(jīng)歷了兩個明顯不同的階段[6]，即血管前期(即無血管期)和血管生長期。在血管前期腫瘤生長較緩慢，而進入血管生長期，腫瘤內生成大量血管，腫瘤的生長也迅速加快，進入快速增殖階段。腫瘤血管是腫瘤生長和轉移的形態(tài)學基礎，除了給腫瘤提供營養(yǎng)之外，還不斷向人體輸送腫瘤細胞，導致惡性腫瘤的轉移。

血管新生在體內受到一系列因子調節(jié)，其中以血管內皮生長因子(VEGF)最為重要，它是維持血管功能和腫瘤擴增的關鍵因子。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤血管生長因子之一，其功能一方面可以誘導內皮細胞增殖、遷移甚至改變其基因表達;另一方面它能增加微血管的通透性，使血漿蛋白滲出于血管外，改變局部的細胞外基質以適應血管生成。腫瘤組織中VEGF的表達水平及血清中VEGF的含量與腫瘤MVD、惡性程度和轉移情況呈高度正相關，而與患者的預后則呈顯著負相關[7]。微血管密度(MVD)是一種反映腫瘤血管形成程度的量化指標，能較為準確地反映腫瘤內的血管狀態(tài)，是反映腫瘤誘導血管生成能力的指標，是一個反映惡性腫瘤生物學行為的重要參數(shù)。

實驗結果顯示，水蛭、斑蝥高低劑量組MMP-9呈低表達，結合VEGF的表達也降低MVD減少的結果，說明新血管生成是腫瘤細胞、基質、細胞因子等共同參與、共同作用的結果，同時也提示MMP、VEGF在腫瘤的血管生成及轉移過程中具有相互協(xié)同的作用。斑蝥、水蛭抑制腫瘤的途徑之一可能是通過抑制新生血管的生成來實現(xiàn)的，而VEGF、MVD和MMP-9之間有著密切的聯(lián)系。

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[3]Rahman A，Dhar DK，Yamagnchi E，et al.Coexpression of Inducible nitricoxide synthase and cox-2 in hepatocellular Careinoma and surrounding liver，possible involvement of cox-2 in the angiogenesis of hepatitis C virus positive case[J].Clin Can Res.2001，7(5):1325.

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