復(fù)方靈尼膠囊對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

李玉梅，薛 欣，張永祥，盧賀起

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

復(fù)方靈尼膠囊在治療艾滋病的臨床實(shí)驗(yàn)觀察中有較好的療效。為深入探討其療效機(jī)理，尤其是促進(jìn)免疫功能的藥理作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制，觀察該藥對(duì)模型動(dòng)物CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值的影響[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性昆明小鼠72只，清潔級(jí)，體重20g±2g，由中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心提供(許可證號(hào)SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 藥物 復(fù)方靈尼膠囊(批號(hào)20090401)，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供，每克復(fù)方靈尼膠囊內(nèi)裝物相當(dāng)于5.44g生藥。成人臨床給藥劑量為10g生藥/人/d。將藥物分別配成濃度5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的水溶液。

陽(yáng)性對(duì)照藥:貞芪扶正顆粒(批號(hào)071110)，由修正藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，將該藥配成濃度為56mg/ml的水溶液。造模用藥:環(huán)孢霉素注射液(批號(hào)S0026A)，瑞士大諾華，稀釋成濃度為1mg/ml工作液，用量為小鼠每公斤體重15mg。

1.1.3 主要試劑和儀器 試劑:FITC標(biāo)記的美洲倉(cāng)鼠抗小鼠CD3單克隆抗體，PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體，PECY5標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體，均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。儀器:日本Tomy SECKO公司高速低溫離心機(jī)RS-20IV型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司流式細(xì)胞儀EPICS XL型。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 將72只小鼠分為A正常組、B低劑量組、C中劑量組、D高劑量組、E模型組、F陽(yáng)性藥組6組，每組12只。除A組動(dòng)物外，其他組動(dòng)物均腹腔注射造模藥物，劑量0.3ml/20g，每隔1d注射1次，共注射3次。造模給藥1周后，除A組和E組動(dòng)物外，其他組動(dòng)物均口服灌胃給藥，每次0.5ml，B、C、D組給復(fù)方靈尼膠囊水溶液，F(xiàn)組給予貞芪扶正顆粒水溶液，每天1次，共持續(xù)14d。

停止給藥后次日，各組動(dòng)物眼眶取血，肝素抗凝，取抗凝血與小鼠單克隆抗體工作液混勻，4℃避光放置30min，用紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，離心1200r/5min，取沉淀細(xì)胞用PBS洗2次后，制成細(xì)胞懸液用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，樣品上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2 流式檢測(cè)條件和指標(biāo) 流式細(xì)胞儀激光發(fā)射波長(zhǎng)488nm，在前向散射和側(cè)向散射二維散點(diǎn)圖上確定淋巴細(xì)胞群，分別收集波長(zhǎng)為525nm、575nm、670nm的熒光信號(hào)，并分別計(jì)算CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分率。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析，結(jié)合q檢驗(yàn)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

復(fù)方靈尼膠囊對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響

表1顯示，模型組小鼠CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞均明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，模型組小鼠CD4+/CD8+比值低于正常對(duì)照組，說(shuō)明模型組小鼠免疫功能受到抑制。復(fù)方靈尼膠囊高、中、低劑量組與模型組比較，CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞明顯升高(P＜0.01)，中劑量組CD4+/CD8+比值亦有所恢復(fù)，說(shuō)明復(fù)方靈尼膠囊具有提高和改善免疫功能的作用。

表1 復(fù)方靈尼膠囊對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞亞群影響

表1 復(fù)方靈尼膠囊對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞亞群影響

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P ＜0.01

組 別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+正 常 組 12 72.87±9.04 51.06±7.78 21.15±3.21 2.45±0.46模 型 組 12 48.47±2.79＊＊ 33.10±2.74＊＊ 14.87±2.52＊＊ 2.14±0.36*陽(yáng)性藥物組 12 74.66±8.68## 47.60±3.92## 26.58±2.15## 1.97±0.39低 劑 量 組 12 75.22±4.01## 48.90±4.39## 25.68±3.72## 1.96±0.40中 劑 量 組 12 73.26±9.56## 49.73±8.98## 23.14±6.38## 2.34±0.63高 劑 量 組 12 73.53±6.50## 47.44±7.97## 25.00±5.09##1.97±0.51

3 討論

CD4+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的免疫反應(yīng)中處于重要地位，它通過(guò)分泌細(xì)胞因子激活其他細(xì)胞亞群參與免疫反應(yīng)，協(xié)調(diào)其間的相互作用，并對(duì)介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫起著重要調(diào)節(jié)作用。HIV病毒感染和艾滋病所引起的重要的病理?yè)p傷:HIV病毒主要攻擊CD4+T淋巴細(xì)胞，使CD4+T淋巴細(xì)胞受損，數(shù)量減少，免疫功能進(jìn)行性下降，最終致使機(jī)體免疫功能喪失。CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能變化是篩選抗艾滋病藥物的重要指標(biāo)之一[2]。中醫(yī)認(rèn)為，正氣存內(nèi)，邪不可干，扶正可以祛邪，而補(bǔ)虛扶正是提高抗病能力、調(diào)節(jié)免疫功能的重要手段，這在很多人體的康復(fù)實(shí)踐中得到證實(shí)[3]。

在治療艾滋病的臨床實(shí)踐中，中醫(yī)藥治療可改善患者臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，推遲艾滋病的發(fā)病時(shí)間[4]。受試藥物是根據(jù)中醫(yī)扶正祛邪理論研制，在臨床觀察中有較好的療效。本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，模型組各指標(biāo)平均值明顯低于正常組和陽(yáng)性藥物組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明小鼠免疫抑制模型的實(shí)驗(yàn)方法可靠。各劑量給藥組的各指標(biāo)平均值與模型組比較均見(jiàn)升高且接近正常組水平，并與陽(yáng)性藥物組各指標(biāo)平均值無(wú)明顯差異(P＞0.05)，表明實(shí)驗(yàn)藥物與陽(yáng)性藥物藥效一致，即復(fù)方靈尼膠囊對(duì)免疫抑制模型小鼠的免疫功能有恢復(fù)作用。但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也同時(shí)顯示，各給藥組 CD4+/CD8+的比值并未恢復(fù)到正常組水平，應(yīng)就其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制做進(jìn)一步深入研究。

[1]張永祥，趙東，李玉梅，等.愛(ài)可扶正片對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能恢復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007，13(3):216.

[2]金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)[M].西安:世界圖書(shū)出版公司，1999:259-285.

[3]盧賀起，黃暉，周艷華，等.“時(shí)相藥法”消除運(yùn)動(dòng)性疲勞機(jī)理的初步研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12(9):665-667.

[4]閆利源，張毅.艾滋病的中醫(yī)病因病機(jī)及治療思路研究[J]中醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，26(152):3-6.