蜈蚣敗毒飲對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響*

楊素清蔡宏婷閆景東王姍姍

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、頑固性紅斑鱗屑性皮膚病，組織病理改變最先發(fā)生真皮乳頭層微血管異常增生。而內(nèi)皮細(xì)胞在銀屑病血管生成中起關(guān)鍵作用，抗內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，從而達(dá)到治療銀屑病的目的 。本研究從抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的角度，通過實驗研究人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），深入探討蜈蚣敗毒飲治療銀屑病的可能機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板：美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱：TC2323D，廣州南方生化醫(yī)學(xué)部；倒置顯微鏡：XDS-1，重慶光電儀器總公司；超低溫冰箱：702ULTFreezer，U.S.A；臺式離心機：TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；高速低溫離心機：Optima TMXL-look Ultracentrifuge，BECKMAN，USA；酶標(biāo)儀：128C，奧地利；超凈工作間：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論實驗室；高糖DMEM培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青；青霉素/鏈霉素：美國Sigma公司；胰蛋白酶：美國Hyclone公司；D-Hank’s緩沖液：美國Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：上海華美公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：美國Hyclone公司。

1.2 藥物蜈蚣敗毒飲，組成：蜈蚣3 g，烏蛇20 g，紫草30 g，鬼箭羽30 g，土茯苓30 g，甘草10 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。上藥加8倍量水浸泡4 h，煎煮1 h，藥渣再加6倍水煎煮，1 h后過濾取汁，將兩次濾出的藥液混合，分別濃縮成1.48、2.97、5.94 g/mL的濃縮液，4℃保存?zhèn)溆?。甲氨蝶呤片，上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H31020644。將6片甲氨蝶呤片溶于134.41 mL蒸餾水中，配成濃度為0.11 mg/mL的混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?fù)方青黛膠囊，陜西天寧制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：Z20010157。將36粒復(fù)方青黛膠囊溶于134.43 mL蒸餾水中，配成藥物濃度為0.13 g/mL的混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞與動物細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC，美國ATCC。健康清潔級Wistar大鼠36只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。室溫23℃飼養(yǎng)，空氣新鮮，自由飲水、攝食。

1.4 含藥血清制備36只Wistar大鼠隨機分成6組，即空白對照組、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組6只?？瞻讓φ战M大鼠每日灌服生理鹽水2 mL/100 g，根據(jù)公式（給藥劑量=臨床常用量×動物等效面積系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度），中藥低、中、高劑量組分別灌服不同濃度的蜈蚣敗毒飲濃縮液（1.48、2.97、5.94 g/mL）2 mL/100 g，分別相當(dāng)于成人所用劑量的5、10、20倍；西藥對照組灌服甲氨蝶呤片混懸液（濃度為0.11 mg/mL）2 mL/100 g，相當(dāng)于成人所用劑量10倍；中藥對照組灌服復(fù)方青黛膠囊混懸液（濃度為0.13 g/mL）2 mL/100 g，相當(dāng)于成人所用劑量10倍。每日分2次灌胃，連續(xù)3 d。末次給藥后1 h，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定在手術(shù)臺上，無菌條件下腹主動脈取血。4℃靜置1 h，4℃離心（3000 r/min，5 min）分離血清，取上層血清56℃、30 min滅活，同組混勻，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HUVEC的培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（56℃滅活30 min）、100 U/mL鏈霉、100 U/m青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次。

1.5.2 細(xì)胞傳代當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%時，棄去原培養(yǎng)液，用D-Hank’s液清洗細(xì)胞2次，吸出D-Hank’s液。加入1 mL 0.25%胰酶溶液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使其均勻分布于細(xì)胞表面。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮、變圓，細(xì)胞間隙增大后，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。反復(fù)吹打細(xì)胞，使之成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種入新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 細(xì)胞計數(shù)用無水乙醇清潔計數(shù)板及專用蓋玻片。制備單細(xì)胞懸液，取待測的細(xì)胞懸液0.1 mL，加D-Hank’s液0.9 mL，均勻混和后滴于細(xì)胞計數(shù)板上。計數(shù)四角的4個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)（計左、計上壓線；細(xì)胞團(tuán)≥2個細(xì)胞，按1個細(xì)胞計數(shù)）。按照下列公式算出細(xì)胞濃度：細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/mL）=4大格細(xì)胞數(shù)之和/4×104×稀釋倍數(shù)。

1.5.4 細(xì)胞凍存將細(xì)胞用0.25%胰酶消化。加入DMEM完全培養(yǎng)基吹打，形成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中離心（1000 r/min，5 min），棄上清液。按5×106個/mL的密度用細(xì)胞凍存液（完全培養(yǎng)基94%、DMSO 6%，于細(xì)胞凍存前配置）重懸細(xì)胞。分裝進(jìn)凍存管，封口，標(biāo)號。用多層脫脂棉包裹后，投入-70℃超低溫冰箱4 h，將凍存管裝入紗布袋中，置于液氮中保存。

1.5.5 細(xì)胞復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，快速置于37℃水浴中，不斷振搖，使其在1 min內(nèi)迅速解凍。取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開；吸出細(xì)胞懸液，置于含有DMEM完全培養(yǎng)基的離心管中離心（1000 r/min，5 min）。棄上清液，以DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后，吹打均勻，使之成單細(xì)胞懸液。將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，倒置顯微鏡下觀察，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換新鮮的培養(yǎng)液。

1.6 細(xì)胞分組及給藥方法 將HUVEC分為6組：即空白對照組、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。將細(xì)胞以2×104/mL密度接種，在37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞己貼壁生長良好，吸棄上清液及未貼壁細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液培養(yǎng)（按DMEM∶胎牛血清∶含藥血清=8∶1∶1的比例培養(yǎng)）?？瞻讓φ战M、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組加入的血清分別為空白血清、甲氨蝶呤片含藥血清、復(fù)方青黛膠囊含藥血清、中藥低劑量含藥血清、中藥中劑量含藥血清、中藥高劑量含藥血清。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法 采用四唑鹽（MTT）比色實驗測定蜈蚣敗毒飲對HUVEC細(xì)胞增殖的影響。用PBS制成5 mg/mL的MTT儲存液，過濾除菌后4℃避光保存。細(xì)胞以2×104/mL密度接種96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞已貼壁生長良好，吸棄各孔上清液及未貼壁細(xì)胞，分別予以藥物處理，方法 同1.6項下方法 。培養(yǎng)48 h后吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄各孔液體，用PBS洗板2次，加入DMSO 100 μL/孔，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm波長用酶標(biāo)儀檢測定吸光度值（OD值），實驗重復(fù)5次。按下列公式計算藥物對細(xì)胞增殖率的影響。細(xì)胞增殖率（RGR）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用（x±s）表示，多組計量資料組間比較采用方差分析，如果多組均值比較有統(tǒng)計學(xué)差異，則采用兩兩比較方法 再進(jìn)行分析，統(tǒng)計學(xué)處理采用SAS9.1。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表1。從表中可以看出，甲氨蝶呤片含藥血清、復(fù)方青黛膠囊含藥血清、蜈蚣敗毒飲含藥血清使體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均有所降低，但只有西藥對照組、中藥中劑量組、中藥高劑量組與空白組比較HUVEC細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；西藥對照組與中藥對照組及中藥低劑量組比較細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；西藥對照組與中藥中劑量組、中藥高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)（P＞0.05）。中藥高劑量組與中藥對照組比較HUVEC細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），從上表中的數(shù)據(jù)可以看出，中藥高劑量組HUVEC細(xì)胞增殖率明顯低于中藥對照組。中藥低劑量組、中藥中劑量組HUVEC細(xì)胞增殖率與中藥對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組HUVEC增殖比較（s）

表1 各組HUVEC增殖比較（s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與西藥對照組比較，#P＜0.05；與中藥對照組比較，△P＜0.05。

組別n細(xì)胞增殖率（%）空白對照組5100西藥對照組581.84±5.78*中藥對照組592.33±6.14#中藥低劑量組592.30±5.74#中藥中劑量組587.45±8.32*中藥高劑量組582.47±5.72*△

3 討論

銀屑病以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生、真皮炎性細(xì)胞浸潤和新生血管形成為其組織病理三要素。其中真皮乳頭微血管的異常增生是其最早發(fā)生的病理過程。在銀屑病中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞加強了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的自我表達(dá)，并通過一系列信號傳導(dǎo)［1］，促進(jìn)血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，最終導(dǎo)致新血管生成［2-4］。目前，銀屑病已經(jīng)被確定為一種慢性炎癥性血管新生性疾病，銀屑病的皮損處可出現(xiàn)真皮乳頭層微血管擴張迂曲，通透性增高，血管數(shù)量增多。銀屑病的復(fù)發(fā)則與皮損內(nèi)真皮乳頭內(nèi)皮細(xì)胞的過度表達(dá)有關(guān)。血管新生是指由已經(jīng)存在的血管床分生出新的血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管新生體外研究的基礎(chǔ)。由此可見，內(nèi)皮細(xì)胞在銀屑病血管生成中起關(guān)鍵作用，抗內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，從而達(dá)到治療銀屑病的目的 。內(nèi)皮細(xì)胞已成為治療銀屑病的重要靶點［5］。

本研究結(jié)果 顯示，蜈蚣敗毒飲的含藥血清能夠明顯抑制HUVEC增殖，并且劑量越高增殖率越低。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，銀屑病的病機較復(fù)雜，外有風(fēng)、濕、熱、寒、內(nèi)有血熱、血燥、血瘀，并與脾、肺等臟器密切相關(guān)，現(xiàn)代醫(yī)家從環(huán)境、地域、季節(jié)、體質(zhì)等方面加深了對其病因病機的認(rèn)識。但從臨床來看，從其初發(fā)來溯源，血熱是其病理基礎(chǔ)，“風(fēng)”邪貫穿始終，“毒”邪作為一重要因素是致病的關(guān)鍵，“瘀”邪是其病理結(jié)果 。蜈蚣敗毒飲由蜈蚣、紫草、土茯苓、鬼箭羽、烏蛇、甘草6味藥組成［6-7］，從“風(fēng)”、“毒”、“瘀”理論出發(fā)。方中蜈蚣辛溫燥烈，走竄性猛，行表達(dá)里，無所不至，息風(fēng)止痙、搜風(fēng)通絡(luò)、解毒，既有祛風(fēng)又有解毒的雙重功用，故方以蜈蚣為君藥。紫草涼血通便，清解血分熱毒；土茯苓祛濕毒，兼能健脾胃、祛風(fēng)濕；鬼箭羽涼血通經(jīng)解瘀毒；上3味藥祛熱毒、瘀毒、濕毒，共為臣藥。烏蛇祛風(fēng)通絡(luò)解毒，佐蜈蚣，剔除經(jīng)絡(luò)之風(fēng)，以疏外風(fēng)，配蜈蚣以祛風(fēng)毒，共為佐藥。甘草，解百毒，調(diào)和諸藥，為使。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)共奏祛風(fēng)通絡(luò)、解毒祛瘀、清熱涼血之功。臨床研究［8］顯示效果顯著。因此蜈蚣敗毒飲可能是通過對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制，從而抑制血管新生達(dá)到治療銀屑病的作用。

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