細胞移植在自體脂肪填充中的應用進展

楊懿愛 綜述 鄭丹寧 李青峰 審校

自體脂肪是良好的軟組織充填材料。目前，抽吸技術和移植技術日益成熟。脂肪注射充填技術的主要問題是移植后的脂肪吸收，以及局部脂肪壞死。隨著再生醫(yī)學研究的深入，使用各類細胞輔助脂肪移植進行臨床治療越來越普遍，有大量文獻進行了相關報道。然而，目前使用干細胞以及其他生物方法輔助脂肪移植的方法尚未統(tǒng)一，本文就細胞輔助脂肪移植的現(xiàn)狀進行綜述。

1 脂肪移植技術存在的問題

目前，脂肪移植后吸收率較高的問題仍未得到解決，脂肪移植后吸收率為20%～90%[1]。有眾多研究對脂肪移植技術進行了改進，如小體積多層次低負壓的移植方法，盡可能確保移植顆粒脂肪的活性，解決了小劑量的脂肪充填難題，但是較大劑量的脂肪移植還是存在液化、壞死、吸收等并發(fā)癥。

脂肪移植技術因吸收率不穩(wěn)定而導致的應用限制[2-3]。2006年，Wolf等[4]隨訪10位使用自體脂肪充填臀部的患者，移植量約350 mL，術后1年內平均吸收率達到24%～36%，認為早期的吸收率無法避免，脂肪移植體積在手術后1年漸趨穩(wěn)定。

除吸收率高之外，有報道認為自體脂肪移植豐乳術后脂肪易壞死，易形成囊腫、硬結和鈣化點[5-6]，Illouz等[3]隨訪820位自體脂肪移植豐乳患者，隨訪時間約11.3年，認為脂肪移植豐胸技術主要的問題是局部囊腫、硬結的形成。Spear等[7]隨訪37位患者，隨訪時間平均49周，1例單側乳房出現(xiàn)蜂窩組織炎，3例出現(xiàn)乳房體積減少及淺表腫塊，出現(xiàn)腫塊的患者中有2例組織活檢發(fā)現(xiàn)壞死、囊腫。Spear等[8]認為只有技術熟練經驗豐富的外科醫(yī)生才可以降低自體脂肪移植的并發(fā)癥，患者在進行自體脂肪豐胸前都應被告知術后應接受長期影像學隨訪，應了解脂肪移植有鈣化、囊腫形成、新生乳房腫瘤難以辨識等并發(fā)癥可能。為克服常規(guī)注射脂肪移植的問題，Yoshimura等[9]提出CAL技術，已應用于臨床，自體脂肪干細胞與脂肪細胞聯(lián)合輔助自體脂肪豐胸，可有效減少局部并發(fā)癥的發(fā)生。

2 細胞移植應用于脂肪移植的現(xiàn)狀

2.1 脂肪來源細胞

，脂肪來源干細胞輔助移植，是目前應用最多的輔助移植方法。Zuk等在2001年，首次從自體脂肪組織中分離出具有多向分化潛能的細胞，即脂肪干細胞（Adipose-derived stem/stromal cells，ADSCs），抽吸的脂肪經分離培養(yǎng)即可獲得ADSCs。脂肪的基質血管成分 （Stromal vascular fraction，SVF），同樣取自脂肪抽吸物，經過膠原酶消化、過濾、離心去除成熟脂肪細胞，分離出富含脂肪干細胞的離心層，即為SVF，包含有多種細胞，其中就包括ADSCs。SVF和ADSCs都是脂肪來源的，但ADSCs的獲取過程復雜，需將脂肪細胞分離、培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中增加了污染風險，經過培養(yǎng)的ADSCs干細胞雖然純度較高，但經過多次傳代，可能分化成其他細胞；而SVF無需培養(yǎng)，獲取過程簡便。

2006年，Matsumoto等[10]將ADSCs與顆粒脂肪混合移植于小鼠皮下，使用脂肪干細胞輔助移植的脂肪體積大于未使用脂肪移植組35%，使用脂肪干細胞輔助移植的脂肪在Dil染色下血管內皮細胞較未使用脂肪移植組高；2009年，Yoshimura將此技術命名為自體細胞輔助脂肪移植技術（Cell assisted lipotransfer，CAL）。該技術將ADSCs提取與顆粒脂肪移植技術相結合，首先使用負壓吸脂術抽吸患者多余脂肪，將所取的顆粒脂肪分成兩部分，一部分用于提取ADSCs，一部分用于脂肪移植，提取好后混合兩部分共同移植至患者自身體內，移植的脂肪即為脂肪干細胞富集的脂肪顆粒，取得良好療效。普通脂肪移植的過程中，移植物中含有一定成分的脂肪干細胞，經過上述處理的目的是增加單位顆粒脂肪移植物中脂肪干細胞的含量[9]，隨訪使用CAL方法豐胸患者1年，充填量約為264 mL，術后2個月無明顯脂肪吸收，術后1年脂肪存活率左側（155±50） mL，右側存活率（143±80） mL。自體脂肪移植豐乳有可能取代假體豐乳[12]。

Kamakura等[13]使用自動提取干細胞裝置Celution 800 system，將經過洗滌和分離的干細胞輔助脂肪移植，每克脂肪組織可以提取3.42×105個干細胞，機器分離前測量脂肪活性約為85.3%，9個月后隨訪了20位日本女性患者，患者術后胸圍較術前增加3.3 cm，術后有2位患者出現(xiàn)脂肪囊腫。

Min等[14]為了解決脂肪移植術后遠期的脂肪存活問題，在動物實驗中使用ADSCs輔助脂肪移植，發(fā)現(xiàn)在移植6個月及9個月后，添加ADSCs的實驗組脂肪體積較對照組大兩倍，并且添加ADSCs的實驗組毛細血管密度較對照組高，移植后的脂肪經過細胞示蹤及基因表達研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可能有增加毛細血管密度的作用，ADSCs可分化成血管內皮細胞和平滑肌細胞，促進血管生成，促進脂肪細胞再生，并分泌VEGFA和IGF-1等生長因子，可防止脂肪細胞凋亡。Mojallal等[15]將人體脂肪細胞混合ADSCs以及膠原支架，分別移植于裸鼠皮下，2個月后取材并行組織學檢測，該實驗分7組：①純化顆粒脂肪組，脂肪組織經過3000 r/min離心棄上層液體后取中間層新鮮移植至裸鼠皮下，術后2個月體積為最初移植的81.8%，脂肪血管化良好、脂肪成活；②相同條件離心后再經膠原酶消化后的脂肪細胞組，移植2個月后，體積為最初的22.5%，完全吸收占50%，50%的脂肪組織肉眼觀察有纖維組織，組織學檢測有脂滴以及空泡；③經培養(yǎng)后的ADSCs組不添加膠原支架，脂肪體積為最初移植的5.3%，完全吸收占60%，40%肉眼可見纖維組織增生，組織學檢測幾乎無殘余的脂肪細胞和新生血管；④膠原支架不含脂肪細胞組，體積為最初移植的72.2%，完全吸收0%，肉眼見白色無血管化的組織，膠原支架上細胞少；⑤培養(yǎng)后的ADSCs加膠原支架以及生物活性因子組，完全吸收0%，在移植2個月后體積為最初移植的87.3%，肉眼觀察脂肪組織在膠原支架上生長，成熟脂肪細胞可見，有豐富的新生血管；⑥ADSCs加膠原支架不加生物活性因子組，形態(tài)上與不加生長因子組無顯著差異，體積為最初移植的79.1%；⑦新鮮獲取的ADSCs添加膠原支架組，移植2個月后，體積為最初移植的70.4%。實驗證明，添加膠原支架以及培養(yǎng)后的ADSCs有防止脂肪萎縮的作用，移植后2個月體積仍為最初移植的87.3%，生物活性因子也有促進脂肪生長的作用。Levi等[16]發(fā)現(xiàn)，hADSCs在鼠顱骨早期創(chuàng)傷模型中起到促進骨愈合的作用，在鼠創(chuàng)傷部位將富血小板血漿與人的ADSCs混合，模擬早期損傷后體內環(huán)境，與hADSCs接觸的顱骨即刻出現(xiàn)骨愈合，對照組陳舊性顱骨損傷骨質增生有限，促進骨愈合的機制可能與ADSCs激活內源性BMP系統(tǒng)有關。

Feng等[17]使用VEGF轉染的脂肪干細胞移植至裸鼠的皮下促進血管新生和存活，移植6個月后，毛細血管密度增加、脂肪細胞壞死和纖維化減少，使用VEGF轉染的脂肪移植術后體積較對照組增加，實驗組新生毛細血管上發(fā)現(xiàn)用于標記脂肪干細胞的Dil標記物，認為新生毛細血管是由ADSCs分化的。由于脂肪組織的血管新生發(fā)生在移植后的48 h，因此，脂肪組織在這段時間里遭遇缺氧，將會發(fā)生細胞核碎裂、細胞膜破裂，導致囊腫（Fatty cysts）形成，游離的脂滴部分被吸收，造成術后存活率不穩(wěn)定，余下的脂滴形成脂肪液化壞死。因此，使用VEGF轉染的ADSCs可以起到加快脂肪移植后缺氧早期的毛細血管新生，改善脂肪早期缺血、缺氧狀態(tài)。ADSCs與BMSCs同樣具有恢復血流的能力[18]。研究表明，ADSCs與BMSCs移植后具有促進創(chuàng)傷修復和促進血管新生的作用[19]。ADSCs移植后，通過內分泌、旁分泌、多向分化的作用，以及調節(jié)局部炎癥反應的作用，促進移植脂肪的成活。

ADSCs輔助脂肪移植進行豐乳手術，目前已經應用于臨床，Tiryaki等[20]在一項臨床應用研究中，對29例進行了ADSCs輔助脂肪移植豐乳術，移植量10～390 mL，術后隨訪10個月，所有的患者皆不需二次脂肪注射即達到良好的美容效果。他們認為，富集的ADSCs在脂肪移植早期起到了促進血管新生的作用，減少了脂肪萎縮，防止脂肪細胞凋亡，調節(jié)局部炎癥反應，達到了良好的臨床效果。Lo Cicero等[21]使用ADSCs輔助脂肪移植，治療聲帶麻痹、聲門閉合不全患者12例，認為ADSCs在脂肪移植中具有促進脂肪長期存活的作用，促進了聲帶細胞外基質分泌，效果優(yōu)于單純的脂肪移植。

2.2 骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種纖維樣成體干細胞，約占骨髓中有核細胞的0.001%～0.01%[22]。

Mauney等[23]使用Ⅰ型變性膠原基質（Denatured Collagen typeⅠ）輔助BMSCs體外擴增，能夠有效促進BMSCs向脂肪細胞分化。Webb等[24]認為，BMSCs和ADSCs同樣屬于間充質干細胞，體內實驗證實ADSCs相比BMSCs增殖速度更快，更易獲取，較適于臨床應用。

2.3 胚胎干細胞

1998年，Thomoson等[25]將人胚胎干細胞移植至裸鼠體內生成畸胎瘤，包含內、中、外3個胚層的組織，如神經、骨、軟骨、消化道上皮等，證明胚胎干細胞具有多向分化潛能。Hillel等[26]認為，胚胎前體細胞具有自我更新能力，可以嘗試在組織工程化脂肪構建中應用，但胚胎干細胞存在倫理學爭議，且存在致瘤性風險，臨床尚無法應用。Rebelatto等[27]比較了各種間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），發(fā)現(xiàn) BMSCs與ADSCs分化成軟骨和骨的能力相似，但ADSCs分化為脂肪的能力較高。

2.4 富血小板血漿

富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是自體全血通過離心得到的血小板濃縮物，1993年Hood等[28]首先提出，并發(fā)現(xiàn)PRP含有豐富的血小板，其數目比全血中數目高3倍以上，并富含血小板因子（Platelet factor 4，PF4）、血小板血管生成因子（Platelet-derived angiogenesis factor，PDAF）、血小板內皮生長因子 （Platelet-derived endothelial growth factor，PDEGF）、胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）、內皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨鈣素（Osteocalcin）、骨連接素（Osteonectin）、纖維蛋白原（Fibrinogen）、纖維連接蛋白 （Vitronectin）、凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin）等生長因子。PRP無免疫原性，不會引起交叉感染，制備使用方便，價格低廉，有良好的應用前景，在創(chuàng)傷修復中起著重要的調節(jié)作用[29-30]。

PRP已輔助用于臨床脂肪移植。2009年，Cervell等[31]使用患者自體的PRP輔助脂肪移植，治療15位面部軟組織填充患者，術后療效滿意。他們認為，PRP含有多種生長因子，當血小板活化后，釋放生長因子，對脂肪增殖有促進作用。他們還比較使用SVF和PRP輔助脂肪移植對下肢創(chuàng)傷后潰瘍的療效，結果顯示使用SVF和脂肪移植聯(lián)合PRP輔助治療可以加快表皮再生速度，對創(chuàng)傷修復有一定的療效。

Nakamura等[30]研究PRP對脂肪成活和吸收的影響，他們提取健康大鼠PRP后，和大鼠脂肪聯(lián)合移植至大鼠皮下，實驗組加入PRP后，移植脂肪在術后30～120 d脂肪呈粉紅色，柔軟，觸之有彈性，對照組單純脂肪移植在30 d后出現(xiàn)顯著吸收。組織學顯示，移植后10 d脂肪細胞形態(tài)和數量相似，PRP組毛細血管密度高；移植20 d后，對照組正常脂肪細胞量減少，實驗組脂肪細胞量維持不變。

3 細胞輔助移植的局限性和前景展望

3.1 細胞移植途徑和安全性

ADSCs與BMSCs一樣，在體外具有向脂肪、骨、軟骨、神經、心肌、平滑肌及骨骼肌等多個譜系分化的能力。ADSCs可分化為血管內皮細胞，且在缺氧環(huán)境下可分泌促進血管形成的細胞因子，從而促進脂肪移植后的血管化進程；ADSCs可以產生和分泌血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF-2）、轉化生長因子（TGFβ）、肝細胞生長因子（HGF）等多種細胞因子，在造血支持作用、趨化作用、免疫抑制和免疫調節(jié)中發(fā)揮功能[14-15，17，21]。

使用細胞輔助移植可以提高移植術后脂肪的存活率，但體外培養(yǎng)需要擴增，最少需要2～3周的時間，如果患者使用自體脂肪細胞輔助移植，就需要二期手術。不僅如此，體外培養(yǎng)操作繁瑣，需要專業(yè)的研究人員和相應的硬件設施，等待二次手術的時間里存在污染風險，安全性低。

因此，使用脂肪組織中新鮮分離的SVF輔助脂肪移植，既可避免交叉感染，具有較高的安全性，又能一期完成手術，易于臨床推廣，PRP也有提取方便和安全性較高的優(yōu)點。

3.2 細胞移植后的作用機制

細胞輔助移植后促進血管化的機制尚不明確，在脂肪細胞受區(qū)血管化過程中，各種因子之間相互協(xié)調，共同發(fā)揮作用。輔助移植的細胞可以持續(xù)分泌多種因子，如肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、 成纖維細胞生長因子（Fibmblast growth factor，F(xiàn)GF）、VEGF、IGF、SDF-I、Angl等，可以促進血管內皮細胞的增殖、遷移、形成管狀結構，并募集周圍組織和血循環(huán)中的內皮祖細胞，促進其分化為內皮細胞[32]。此外，植入的細胞還可以通過分化為血管內皮細胞，參與新生血管壁的形成；或者作為促血管化生長因子基因的載體，從而顯著提高移植脂肪的成活率[15，32]。

脂肪移植后，體內局部微環(huán)境發(fā)生改變，新生血管未生成，缺氧會影響植入脂肪的存活率，并導致微環(huán)境中的細胞因子、細胞外基質逐漸減少，影響最終的治療效果[12]。因此，了解脂肪移植后的轉歸，對抗早期缺氧，調節(jié)脂肪細胞與輔助細胞的作用，可能會成為未來的研究方向。

隨著對于細胞輔助移植后脂肪的轉歸、作用機制、調控機理等的深入研究，細胞輔助脂肪移植有望解決長期存在的脂肪移植的液化、壞死等并發(fā)癥，使得脂肪移植技術能更好地應用于臨床。

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